干货丨全RNA体系CRISPR-Cas9基因编辑Protocol及T7E1酶切效率筛选方法

生物_医药_科研 2019-08-24

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我们知道，RNAi是从mRNA水平对目的基因进行沉默，而CRISPR-Cas9是从基因组水平对目的基因进行敲除或消除目的基因在细胞内的表达，让靶蛋白的功能下调或完全丧失，Cas9靶点的选择范围相比RNAi也更加广泛，包括所有基因组序列，如外显子、内含子、启动子、增强子、基因间隔序列等。

2019年国家自然科学基金以CRISPR为关键词的项目资助金额达到3485万元，伴随CRISPR体系的不断优化与应用深入，CRISPR-Cas9也逐渐成为越来越普遍的基因功能研究工具而进入更多实验室。

CRISPR-Cas9与RNAi的区别

关于全RNA体系的CRISPR-Cas9工具

在众多CRISPR-Cas9基因编辑工具中，全RNA体系的CRISPR-Cas9由于不需要构建质粒或包病毒载体，一次可同时靶向编辑更多目的基因，细胞毒性小，操作难度大大降低，准备工作更少，周期更短，同时性价比更高，实验环境更为友好，极大地降低了基因编辑技术的门槛和实验复杂程度，提高了实验的成功率和普及率。

所谓全RNA体系，就是CRISPR-Cas9采用天然复合物系统（crRNA与tracrRNA）和Cas9 mRNA，其中Cas9 mRNA直接在细胞内瞬时表达Cas9蛋白，无任何DNA组分或其他表达元件，组成一个即用型体系，同时经专利技术优化以实现真正高效简单地编辑。

今天小编就以锐博生物的CRISPR-Cas9体系（中国专利号:108977442A/PCT申请号:CN2018/088105），为大家详细介绍全RNA体系的riboEDIT™ CRISPR-Cas9具体操作方法以及T7E1酶切筛选最有效的crRNA的方法，希望对进行基因敲除、瞬时基因表达、构建稳转株或动物胚胎干细胞等CRISPR实验的小伙伴们，提供更简单有效的实现途径！如果您遇到了目的基因编辑效率低、很难沉默或敲降、脱靶严重、实验繁复或周期太长，或想一次转染同时编辑细胞内多个靶基因，希望细胞毒性小，或者不愿冒险接触病毒类实验操作，您就可以果断地尝试这一创新的全RNA体系了！

体系的运输保存

低温运输：riboEDIT Cas9 mRNA，riboEDIT T7EI Enzyme（液态储存）、riboEDIT tracrRNA、riboEDIT crRNA、riboEDIT Positive Control crRNA Validation Set（阳性对照为冻干粉形式，上下游引物为液态存储）等组分为干冰运输，riboFECT mRNA Transfection Reagent 为4°C冰袋运输。

保存方式：-20 °C 低温冻存，避免反复冻融，长期请置于-80℃保存，实验过程置于冰上放置，使用完毕后请于-20℃~-80℃小心保存。

CRISPR-Cas9全RNA体系操作方法

因不存在DNA插入的风险，riboEDIT™ CRISPR-Cas9全RNA体系是一种更安全的体系并已获得专利。riboEDIT Cas9 mRNA是体外转录生成的Cas9 mRNA，具有帽子和polyA尾巴结构，编码序列采用人源密码子优化的S. pyogenes Cas9，带有核定位信号（NLS），C端的一个1XFLAG标签，5’非翻译区 (5’UTR)及3’非翻译区(3’UTR)，以促进mRNA的翻译和提高mRNA的稳定性，与经优化的缩短长度的crRNA和tracrRNA共同使用，适用于哺乳动物细胞的基因高效率编辑，相比载体、慢病毒或稳转株体系具有诸多优势。

实验准备（以转染24孔板为例）

(1) 将riboEDIT tracrRNA（5nmol）和riboEDIT crRNA（5nmol）分别加入250μL RNase-free H2O，各自稀释至20μM，作为储存溶液。使用前，用RNase-free H2O进一步稀释至10μM，置于冰上备用。注：riboEDIT tracrRNA和riboEDIT crRNA可根据具体实验体系稀释至合适的浓度使用。

(2) riboEDIT Cas9 mRNA（500ng/μL），置于冰上备用。

实验步骤

(1) 准备细胞：转染前18-24h，取对数生长期细胞接种于24孔板中，实验前细胞密度达到50%~70%为宜。

(2) 取一支1.5mL EP管，加入25μL Opti-MEM减血清培养基，再加入2μL riboFECT mRNA Transfection Reagent转染试剂，室温孵育10min。（不建议加双抗）

(3) 另取一支1.5mL EP管，加入25μL Opti-MEMTM减血清培养基，然后加入2μL riboEDIT Cas9 mRNA（500ng/μL）。

(4) 然后加入1μL tracrRNA（10μM）和1μL crRNA（10μM），crRNA和tracrRNA按1:1加入。不同孔板转染体系可按照表1自行优化。

(5)将crRNA、tracrRNA、Cas9 mRNA混合物加入到稀释的转染试剂中，室温孵育5min。

(6)孵育结束后，将上述制备好的转染复合物加入到细胞培养基中，继续培养48~72h。

(7)提取基因组，使用riboEDIT T7EI Enzyme进行基因编辑效率检测。

表1. riboEDIT™ Cas9 mRNA转染体系

* 转染体系需确保转染总量(pmol)，pmol/μM=加入的体积

* 请保证crRNA和tracrRNA按1:1加入

T7E1酶切检测靶位点编辑效率

操作说明

在细胞转染后，建议使用T7E1酶切法筛选编辑效率高的crRNA进行下游实验。

实验步骤

（1）提取基因组：细胞转染后48-72h后，收集细胞抽提基因组，并用微量紫外分光光度计定量。

（2）PCR扩增靶基因片段：将纯化得到的基因组DNA稀释至合适的浓度范围，吸取100ng-500ng基因组DNA用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，阳性对照组使用riboEDIT™ Positive Control crRNA Validation Set的引物进行扩增，引物信息见表2。

注：基因组DNA模板用量及PCR条件需根据反应体系自行优化。

表2. riboEDIT Positive Control crRNA Validation Set 引物序列

（3）DNA片段退火：DNA片段按照表4退火体系进行混合，充分混匀后置于PCR中运行退火程序（表4）。或95℃加热5min，然后自然冷却至室温。

表3. 退火体系

表4. DNA双链退火程序

（4）T7EI酶切：退火完成后，每管加入0.5μL riboEDIT™ T7EI Enzyme（10U/μL），37℃温育30min。

（5）电泳检测： T7E1酶切后，产物进行纯化，然后使用2%-3%琼脂糖凝胶电泳或Agilent 2200 Tape Station检测酶切条带和编辑效率。

高效编辑结果展示

MHCC97H细胞共转染10pmol riboEDIT™ crRNA、10pmol riboEDIT™ tracrRNA和1ug riboEDIT™ Cas9 mRNA，48小时后 riboEDIT™ T7EI Enzyme酶切检测靶位点的剪切效率，候选7个靶基因的剪切条带及编辑效率。其中，针对7个目的基因分别设计2条crRNA，其中9条crRNA及其配套体系的编辑效率均达到50%以上，编辑效率最高的一条达到81.1%，其中Indel%表示T7E1酶切检测的编辑效率。