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Sherene Loi, Damien Drubay, Sylvia Adams, Giancarlo Pruneri, Prudence A. Francis, Magali Lacroix-Triki, Heikki Joensuu, Maria Vittoria DieCI, Sunil Badve, Sandra Demaria, Robert Gray, Elisabetta Munzone, Jerome Lemonnier, Christos Sotiriou, Martine J. Piccart, Pirkko-Liisa Kellokum Pu-Lehtinen,Andrea Vingiani, Kathryn Gray, Fabrice Andre, Carsten Denkert, Roberto Salgado, Stefan Michiels 点评 山重水复疑无路，柳暗花明又一村 ——论肿瘤浸润淋巴细胞在早期三阴性乳腺癌预后中的意义 点评专家： 吕铮 吉林大学第一医院 三阴性乳腺癌是乳腺癌所有分子亚型中预后最差的一种亚型，相比 Luminal 型和 HER-2 过表达型乳腺癌，三阴性乳腺癌缺乏靶向治疗和内分泌治疗，化疗仍是辅助治疗的唯一全身治疗手段；同时预后方面，三阴性乳腺癌缺乏用来区分复发风险高低和是否可以放弃化疗的多基因标签，如 21 基因检测、MammaPrint 70 基因检测、EndoPredict® （EpClin）和 Breast Cancer Index（BCI）等，目前还需依赖组织学分级、肿瘤大小、淋巴结转移等病理指标来判断预后。对于三阴性乳腺癌的研究似乎已到了山重水复的境地。 已有研究发现，对于多种实体肿瘤如黑色素、卵巢癌等，肿瘤微环境中肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor-Infifi ltration Lymphocytes, TIL）的高度浸润往往提示较好的预后，Aaltomaa 等也在 1992 年首次报道了乳腺癌中 TILs 的预后作用。随着研究的进展，已经有研究陆续报道了 TIL 在早期三阴性乳腺癌中预后的意义。本研究将已经发表的 9 个前瞻性研究和大型回顾性研究中三阴性乳腺癌患者的原始病理资料，利用汇总分析的方法，重新分析了间质 TIL（stromall TIL, sTIL）与预后的关系，发现 sTIL 可以预测 iDFS、D-DFS、OS 等生存指标，每增加 10% sTIL，iDFS、D-DFS、OS 也随之增加，并且在淋巴结阴性的三阴性乳腺癌中，sTIL 高于 30% 的患者，3 年的 iDFS、D-DFS、OS 均可达到92% 以上。 这个研究结果似乎让我们看到了柳暗花明又一村的景象。sTIL 可能会成为类似 21 基因一样的预测指标，将三阴性乳腺癌区分为预后不同的亚组，对于预后好的患者，我们也许会放弃化疗，或者降阶梯化疗，如仅用 AC/TC 等；对于预后差的患者，我们可能会更倾向于应用密集的 AC-T 等强度较大的方案。 本研究采用的汇总研究，区别于荟萃分析，它能够利用原始资料进行更深入的数据合并和再分析，尽管花费较大的人力、物力，但是可以将不同研究中的 sTIL 原始资料按照统一标准分析，同时可获得大样本资料，使得本研究的证据级别更高，结果更可靠，更有可能应用于临床实践。sTIL 常用的检测手段是免疫组织化法，但评价标准尚无统一规定。2014 年国际 TILs 工作组（International TILs Working Group）进行了统一规定，建议通过计算 TILs 在肿瘤浸润范围内所占面积（并非数量）的百分比进行评估。本研究也着重强调了检测方法的一致性和可重复性，这为临床推广提供了前提。 本研究也存在一些局限性，比如纳入的人群不是近 10 年诊断的患者，这可能影响生存分析；sTIL 的浸润程度以30% 为界，目前还需要更多前瞻性的研究进一步得出更精准的界限值，指导临床医师判断三阴性乳腺癌的预后。 摘要 目的 本 研 究 是 对 肿 瘤 浸 润 淋 巴 细 胞（tumor-infifi ltrating lymphocytes, TILs）在早期三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer, TNBC）中的预后价值进行汇总分析。 方法 所纳入的研究评估了位于间质 TILs（stromally TILs, sTILs）的浸润比，这些 TILs 以相同的方式在接受以蒽环类药物为基础或联合紫杉类药物治疗的早期 TNBC 患者诊断样本中进行定量分析。试验分层的 Cox 比例风险回归模型用于分析无侵袭性疾病生存期（invasive diseasefree survival, iDFS；主 要 终 点）， 无 远 处 疾 病 生 存 期（distant disease-free survival, D-DFS）和总生存期（overall survival, OS），以根据临床病理因素调整的 sTILs 作为连续变量。 结果 我们收集了来自 9 项研究的共 2,148 例患者的数据，平均年龄为 50 岁（22-85 岁），33% 的患者为淋巴结阴性。sTILs 平均值为 23%（标准差，20%），77% 的患者sTILs 值不低于 1%。年龄越大（P=0.001），肿瘤越大（P=0.01），浸润的淋巴结数量越多（P=0.02），组织学分级越低（P=0.001），则 sTILs 数量越少。共观察到736 例 iDFS 和 548 例 D-DFS 以及 533 例死亡事件。在多变量模型中，sTILs 为所有终点增加了重要的独立预后信息（相似比 χ2，48.9 iDFS；P<0.001；χ2，55.8 D-DFS；P 0.001；χ2，48.5 OS；P<0.001）。sTILs 中每增加 10%，与之对应，iDFS 风险比为 0.87（95% 置信区间 [confifi dence interval, CI]，0.83-0.91），D-DFS 风险比为 0.83（95% CI，0.79-0.88），OS 风险比为 0.84（95% CI，0.79-0.89）。sTILs ≥ 30% 的淋巴结阴性患者，3 年 iDFS 为 92%（95%CI，89%-98%），D-DFS 为 97%（95% CI，95%-99%），OS 为 99%（95% CI，97%-100%）。 结论 这项汇总数据分析证实了 sTILs 在早期 TNBC 中的强预后作用以及辅助化疗后高 sTIL 患者生存率更佳，并支持将 sTILs 整合到 TNBC 患者的临床病理学预后模型中。该模型见 www.tilsinbreastcancer.org。 前言 在对乳腺癌患者进行预后评估时，通常不考虑宿主微环境。无论是我们还是其他学者早前的研究，已经表明早期三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer, TNBC）和人表皮生长因子受体 2（human epidermal growth factor receptor 2, HER2）阳性乳腺癌样本中免疫相关细胞浸润比例越高，则临床结果越改善明显[1]。浸润比通过苏木精 -伊红染色的标准诊断方法进行定量，这种简单的量化肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infifiltrating lymphocytes, TILs）在以计算出肿瘤和周围间质中的浸润百分比的方法已被证实是一种可重复的生物标志物，可以在全球标准临床病理学中进行相对简单的实施[2,3]。 目前早期 TNBC 的主要预后因素代表的是解剖学上的肿瘤负荷。在这项主要从大型临床研究中获得的患者数据的汇总分析中，我们试图最终确定 TILs 在该乳腺癌亚型中的预后价值。这些证据将有力地支持未来乳腺癌预后分期系统中早期 TNBC 应用新的生物标志物[4]，这些标志物可以用作为临床试验分层因子，并有可能指导乳腺癌的免疫治疗发展。随着免疫检查点阻断剂的应用在其他实体肿瘤类型中不断获得成功，明确乳腺癌免疫浸润的预后作用十分必要。 因 此， 本 研 究 的 主 要 目 的 是 深 入 了 解 间 质 TILs（stromal TILs, sTILs）生物标志物在接受标准辅助化疗治疗的早期 TNBC 中的预后价值。我们通过对来自多个个体研究的 2,000 多例患者的数据进行汇总分析，其中TILs 都是以相同的方式即苏木精 - 伊红染色的标准诊断方法进行评估[3]。使用先前选择的 sTILs 变量用于初步分析，仅在二级分析中使用肿瘤内 TILs（intratumoral TILs, iTILs）。此外，来自多种不同类型研究的大数据集合为预测模型的开发和验证提供了新的机会[5]；因此，我们的次要目的是开发和验证预后模型，该模型将 TILs 评估与传统临床病理因素相结合，这将有助于临床医生做出更全面、更准确的预后评估。我们还试图确定 TIL 的预后效果是否在接受蒽环类药物或联合紫杉类药物的早期TNBC 患者中有定量差异，这也许可以表明化疗药物的种类对其预后影响是否重要。 方法 患者数据集 此次合作项目的研究方案由入选的研究人员制订，并于 2014 年 11 月得到了 Gustave Roussy 当地的机构审查委员会的批准和法国国家计算机和自由委员会的授权。 已有前瞻性随机临床试验或大型回顾性医院系列的研究评估了 TILs（间质和肿瘤内）同在辅助治疗中接受了相同的指定的蒽环类化疗或联合紫杉类药物治疗的早期 TNBC 确诊患者的预后相关性[6-13]。接洽所有做过相关报告或参与过 TIL 评估的研究人员和团队，均答应参与本研究。使用个体患者数据元分析技术对个体患者水平数据进行整理、核对和汇总（图 1）。  TIL 的量化 根据国际免疫肿瘤学生物标志物工作组的指南对sTIL 和 iTIL 进行量化[2,3]。方法详情可在网页（www.tilsinbreastcancer.org）上免费获取，且该网页为病理学家提供了免费的 TIL 评估培训工具。基于本研究的目的，获得PACS01 和 PACS04 临床试验中尚未发表的 TILs 数据（由R.S. 和 M.L. 提供）。sTILs 变量作为汇总分析的主要预定义的生物标志物，因为与 iTILs 相比，它已被发现具有更高的可重复性[2,3]。统计分析 预定义的主要终点是无侵袭性疾病生存期（invasive disease-free survival, iDFS），规定为首次浸润复发的日期，或任何原因导致的第二终点或死亡的日期[14]。无远处疾病 生 存 期（distant disease-free survival, D-DFS）规定为首次远处复发或任何原因导致死亡的日期。以上没有发生本研究关注事件的存活患者最近一次到医院行检查的时候，我们对其进行访视。总生存期（overall survival, OS）定义为任何原因导致死亡的日期。仍然存活的患者在最后一次就诊时访视。我们使用 Kaplan-Meier 方法建立生存曲线，并使用 log-rank 检验来比较各亚组的生存曲线。 使用具有 gamma frailty 的 Cox 比例风险回归模型进行单变量和多变量风险分析以解释研究异质性。我们使用趋势检验和基于 Schoenfeld 残差的图形诊断验证比例风险假设，以及使用拟合样条验证对数线性假设。使用研究校正的线性回归进行与临床病理学变量的相关性分析。 进行 Cochrane Q 检验并且估算每个终点的 I2 指数以确定每项研究之间的异质性（I2=0 表示没有异质性，I2 值与异质性成正比）。在多变量模型中，我们使用似然比检验来评估 sTILs、iTILs 和临床病理因素的影响（年龄；肿瘤大小分级：T1，T2，T3+；淋巴结阳性数目；组织学分级：1 和 2 v 3；以及化疗方式：蒽环类药物 v 蒽环类药物联合紫杉类药物）。在 ECOG 2197 研究中，对Cox 模型进行加权以考虑病例对照样本[6]。  患者特征 总共纳入了包含 2,148 例患者个体数据的 9 项研究，用于初步分析中评估 sTILs 的预后价值。这些研究及患者特征列于表 1 和数据补充中。仅有一个数据集[10]不是前瞻性临床试验。对于 iDFS 终点，中位随访时间为 6.58年（范围为2.71-9.12年），共736例事件（补充数据）。D-DFS终点的中位随访时间为 6.99 年（范围为 3.50-9.54 年），共 584 例事件。OS 终点的中位随访时间为 7.15 年（范围为 4.18-9.61 年），有 533 例事件。在这 2,148 例患者中，1,826 例（84.7%）同时具有多变量模型的 sTIL 和完整的临床病理学信息（图 1 和表 1）。 平均sTILs水平为23%（标准差，20%；范围0%-95%），中位数为 15.00%（四分位数间距，10%-30%）。研究提供了柱状图，并在补充数据中提供了总数据。淋巴结阴性肿瘤患者占该队列的 32.9%（706/2,148）（平均 sTIL水平，20.2%；标准差，20.3%），所有患者均接受单独使用蒽环类药物（55.8%）或联合紫杉类药物（44.2%）作为辅助化疗。共有 1,592 例患者（73.8%）接受了 iTIL评估，1,144 例患者（53.1%）具有完整的临床病理信息（补充数据）。在这个汇总的数据集中，sTILs 和 iTILs 的数量具有很强的相关性（R=0.63；P<0.001）。 与临床病理因素的联系 随着年龄的增长，sTILs 数量显著降低（线性模型，P=0.001）。肿瘤负荷与存在的 sTIL 数量之间存在明显的负相关关系（肿瘤大小 P=0.01；更多节点 P=0.02；补充数据）。与之前的报告相符，组织分级越高，TIL 数量越多（P=0.001）。 iTIL 的预后分析结果相似（补充数据），在每个终点的研究之间同样没有显著的异质性。总体而言，iTIL增加 10% 相当于 iDFS 的 HR 为 0.74（95% CI，0.65-0.85），D-DFS 的为 0.73（95% CI，0.62-0.84），OS 的为 0.76（95%CI，0.65-0.88）。 预后 sTIL 探索性阈值 图 3 描绘了使用 sTILs 探索性水平阈值 30% 的生存曲线，图 4 显示了由节点状态和阈值分层的生存曲线。尽管预后受到变量和线性的影响导致在 Cox 比例风险回归模型中很难选取阈值，但选择百分比作为阈值是因为它反映了整个研究中三个临床终点的 sTILs 水平的最高四分位数。全部亚组和整个人群中所有三个终点的 3 年和 5年生存概率估计值见补充数据。在所有节点类别中观察到生存结局的绝对差异很大。对于所有淋巴结阴性并且诊断出至少有 30% sTILs 的 TNBC 患者（n=213），可以观察到预后良好，估计 3 年 iDFS 为 92%（95% CI，89%-98%），3 年 D-DFS 为 97%（95% CI，95%-99%），3 年OS 为 99%（95% CI，97%-100%）。 当聚焦到至少有 30% sTILs 的 T1-2，N0 亚群——三分之一淋巴结阴性人群（206/684）的 3 年 iDFS，D-DFS和 OS 的估计值分别为93%（95% CI，90%-97%），98% （95% CI，95%-100%）和99%（95% CI，98%-100%）。 讨论 在这项研究中，我们通过汇总来自 9 项大型研究的个体患者水平数据，全面证明了诊断时间质 TILs 的数量是早期 TNBC 的一个独立的预后因素，并为结合标准临床病理因素时估计生存期增加了重要的预后信息。因此，尽管抗肿瘤免疫反应很复杂，但这些数据强烈表明，诊断时预先存在的免疫细胞浸润量与接受蒽环类为基础化疗的早期 TNBC 患者的生存结局密切相关。间质 TILs 相关方法的评定已经发表，并且可重复性已经得到证实[3,16]；因此，我们的数据表明，这种新的生物标志物可以应用于临床，并可在全球范围内用于患者预后和临床试验分层。我们的预后模型可以在线免费获取，这将促进全世界临床医生、病理学家以及希望对外证实其 TNBC 数据集中模型的研究人员去使用本模型[17]。 在本研究中，具有预后价值的是在诊断时观察到的基线 TILs 浸润量。由于本研究中的所有患者都进行了乳腺手术，并且进行了辅助化疗，这表明尽管产生了高TIL，原发性肿瘤仍不能被宿主免疫系统彻底根除，但却必须开始有效的抗肿瘤免疫记忆。已经证实在原发性乳腺癌中 T 细胞是主要浸润的免疫细胞[18]。为了支持这一点，通过免疫组织化学评估 CD8+ T 细胞的数量也被证实具有预后性[16,19]。通过免疫细胞浸润量观察到异质性和乳腺癌中 T 细胞受到驱动的生物学机制在很大程度上是未知的。假设体细胞和种系突变、基因组不稳定性、细胞内抗原和微生物组等宿主因素都对此有影响[20-22]。有趣的是，我们观察到 TILs 数量与肿瘤大小及淋巴结数量之间呈反比关系，证实癌症导致的免疫逃避与增加的疾病负担，但组织学分级水平升高，证实基因组不稳定性可能是触发因素[23]。一般来说，可能除了 BRCA 种系突变肿瘤之外，乳腺癌的突变负荷较低[24]。目前尚不清楚高 TIL 的 TNBCs 中是否存在 T 细胞亚群差异，或者仅仅是数量上的差异决定预后。对 TIL 异质性的分子基础的进一步研究可能会提供信息。 我们观察到间质 TIL 值对重要临床病理因素提供的上述所有生存终点均产生强预后影响。可以推测，产生有效的抗肿瘤免疫反应可能会显著提高低 TIL 水平患者的生存期，尽管我们的数据不能直接支持这一点。鉴于绝大多数早期 TNBCs 含有至少 1% 的 TIL，在这种情况下需要预先存在反应的免疫治疗剂可能是有效的[25]。有必要对于化疗的持续时间和类型进行更多研究，以通过联合用药增强或促进免疫反应来优化免疫治疗，例如免疫检查点阻断剂。 本研究的优点之一在于纳入了来自包括大型前瞻性临床试验在内的多个不同研究的大量患者。使用 30% 或更高的间质 TILs 探索性阈值，观察到良好生存期数据以支持 TILs 生物标志物的临床有效性。这表明未来该生物标志物可以被纳入早期淋巴结阴性 TNBC 的预后分期系统，类似于最近对激素受体阳性、HER2 阴性、淋巴结阴性疾病患者的预后 21 基因检测的整合[26]。已证实病理医师经过充分训练后，可再重现这一间质 TIL 分数[2]。局限在于我们的研究未纳入在过去 10 年中被诊断为乳腺癌的患者，这可能会影响生存估计。此外，尚不清楚有良好结局的 TILs 生物标志物的确切免疫亚群。虽然这项研究没有直接论证具有高 sTILs 的淋巴结阴性 TNBC 亚组患者在接受基于蒽环类药物（或联合紫杉类药物）化疗后具有良好预后、没有恶化这一问题，但对于鉴定具有良好预后的该亚组仍然是有用的。排除高 sTILs 和淋巴结阴性患者的这一亚组，通过为具有良好结局的患者降低毒性、减少成本的方式，在未来也可能有益于早期TNBC 新疗法的临床试验以及一定数量的患者。未来对所提出的 sTIL 阈值进行的前瞻性验证，也能研究出这是否可以帮助临床医生鉴别具有良好预后的 TNBC 患者，这些患者可能需要较低强度的类型和传统细胞毒性化学疗法。         |
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