作者：鲁凤民 曾婉嘉 文夏杰 廖昊 邹军 王雷婕 席婧媛 王建文 王杰 陈香梅
基金项目：“十三五”传染病防治科技重大专项（2017ZX10302201）
作者单位：100191 北京大学基础医学院病原生物学系暨感染病研究中心
通信作者：
鲁凤民，Email：lu.fengmin@hsc.pku.edu.cn；
陈香梅，Email：xm_chen6176@bjmu.edu.cn
慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染是我国病毒性肝炎、肝硬化和肝癌的最主要致病因素，我国现有慢性HBV感染者约7800万人，慢性乙型肝炎（CHB）患者约2400万人[1]。随着疾病进展，约20%~40% CHB患者将发展为肝硬化、肝硬化失代偿等终末期肝病及肝癌[2]。我国的肝癌患者占全世界新发肝癌病例的50%以上，且80%以上的病例与慢性HBV感染有关。因此对CHB患者开展及时、规范的抗病毒治疗以阻断疾病进展，减少终末期肝病的发生至关重要。
目前临床上使用的抗病毒药物主要有长效干扰素和核苷（酸）类药物（NAs）。NAs抑制病毒复制的作用更为明显，且口服方便、不良反应相对较少，在临床上被广泛使用。但无论是NAs还是长效干扰素，各大指南目前仅推荐对有明显肝脏炎症及肝纤维化、肝硬化的CHB患者进行抗病毒治疗。本文总结了当前CHB在实验室诊断和治疗疗效监测中遇到的新问题，同时也讨论了近期发现的CHB新型标志物的临床应用价值，并对这些标志物在CHB抗病毒治疗中的应用进行展望。
一、慢性HBV感染的自然史
慢性HBV感染是一个病毒复制与宿主免疫相互作用的动态过程，其自然史可分为四个时期，分别是免疫耐受期、免疫清除期、低活动或非复制期和再活动期。免疫耐受期的血清HBV DNA水平很高，但肝脏的免疫病理损伤轻微，ALT正常或仅略升高，称为HBeAg阳性慢性HBV感染。随着机体免疫耐受状态被打破进入免疫清除期，患者出现典型的慢性肝炎症状，也称为HBeAg阳性CHB。持续的免疫应答会使部分CHB患者的病毒复制被控制，肝脏炎症得到改善，反映病毒活跃复制的HBeAg转阴，进入免疫控制期，即HBeAg阴性慢性HBV感染。其中有些患者会发生病毒复制再激活，并引发肝脏炎症损伤，成为HBeAg阴性CHB患者（图1）。
图1 慢性HBV感染的自然史（修改自文献）[2]
二、CHB抗病毒治疗相关实验室诊断和疗效监测中遇到的新问题
（一）如何确定亟需抗病毒治疗的CHB患者，并使其得到及时治疗？
因活动性肝脏炎症会加速疾病进展，需要及早进行抗病毒治疗，因此，包括ESAL/APASL/AASLD在内的各大指南均以血清HBV DNA、血清ALT水平和肝脏疾病严重程度来联合评判是否开始CHB的抗病毒治疗。目前临床上多以ALT的异常升高作为肝脏炎症损伤的判定指标，但多项研究显示，有13.8%~47.65%的CHB患者尽管存在明显的肝脏炎症损伤，但ALT并无明显升高[3]。考虑到ALT指标不足以完全反映肝脏损伤，各大指南进一步补充将肝脏有中度或以上的纤维化或炎症坏死作为抗病毒治疗的指征。肝组织活检是目前诊断肝纤维化和肝脏炎症的金标准，但由于其有创性和潜在风险，难以在临床上广泛应用。为发现这些ALT不升高但需要治疗的患者，临床上亟需一些新的可用于肝脏炎症诊断和肝纤维化严重程度评估的指标，以及时甄别需要抗病毒治疗的CHB患者。
（二）如何对NAs抗病毒治疗的疗效进行评估与监测？
HBV DNA水平不仅是决定患者是否进行抗病毒治疗的重要依据，同时也是评价患者病毒学应答的指标。然而，在接受新一代NAs如恩替卡韦或替诺福韦酯治疗1年后，患者的HBV DNA转阴率（下降至检测下限之下）分别为67%和76%。那么，血清HBV DNA转阴后该如何继续进行抗病毒疗效评价？虽然NAs药物能使血清HBV DNA迅速转阴，但若此时停药往往会出现病毒学反弹甚至病情加重，因此现有指南均推荐对患者进行1~3年不等的巩固治疗或长期治疗；且对HBeAg阴性的患者要长期治疗直至血清HBsAg消失，即患者获得“临床治愈”。然而，很少一部分患者可以获得HBsAg转阴，同时缺乏其他评估患者停药风险的可靠指标，所以临床上NAs药物的停药指征并不具有可操作性。考虑到停药有较高的复发风险，多数指南在推荐停药的同时强调了抗病毒治疗用药的长期性。而长期用药又给CHB患者带来经济、社会和心理学上的压力，对患者依从性也是一个考验。如何确定这些患者的治疗终点以及部分患者是否可以安全停药，也是极具争议的临床问题。
总之，目前CHB的实验室检测存在亟需解决的两大问题：（1）寻找新的用于评估肝脏炎症和纤维化严重程度的指标，及早鉴别需抗病毒治疗的CHB患者，使其及时得到治疗；（2）寻找新的用于NAs药物巩固治疗阶段评价患者病毒学应答的指标，以反映共价闭合环状DNA（cccDNA）的存在及活性，为接受NAs巩固治疗的CHB患者提供个体化的停药风险指导。
三、近期发现的CHB相关新型标志物及其临床应用价值
（一）用于确定抗病毒适宜人群的新型标志物
血清中乙型肝炎核心抗体（抗-HBc）是HBV既往感染和正在感染的重要标志。乙型肝炎核心抗原（HBcAg）免疫原性强，能够刺激机体产生强烈的免疫反应，所以急性HBV感染恢复后的很长一段时间内抗-HBc都是阳性。临床常规开展的抗-HBc检测只能定性反映是否感染过HBV。最近，夏宁邵团队开发了抗-HBc定量检测试剂。临床研究表明，血清抗-HBc定量水平与慢性HBV感染自然史的不同时期有着非常密切的关系，免疫耐受期抗-HBc水平相对较低，免疫清除期抗-HBc水平较高，而在非活动HBsAg携带或者低复制期时抗-HBc水平很低。此外，ALT正常但可能存在肝脏损伤和炎症的慢性HBV感染者，其血清抗-HBc水平也更高，提示抗-HBc定量水平与肝脏炎症状态密切相关[4]。因此血清抗-HBc定量检测可以弥补部分因ALT未升高导致的CHB患者漏诊。
高尔基体蛋白73（GP73）之前一直被认为是肝癌的诊断标志物，但我们和其他实验室的研究发现，血清GP73实际上是一个反映肝纤维化及肝硬化的标志物[5-6]。近期的一系列研究结果表明，血清GP73与肝脏炎症活动度具有相关性（相关系数0.524），可能也是肝脏炎症的潜在标志物。进一步研究发现，对于HBeAg阳性或阴性的CHB患者，GP73对中度以上的肝脏炎症活动度的ROC曲线下面积分别为0.782和0.841。通过多因素分析，将适用于肝脏炎症活动度诊断的指标如AST、GGT组合，建立肝脏炎症活动的联合诊断模型HIM（hepatic inflammation diagnosismodel）。对于中度以上炎症活动度诊断效能ROC曲线达到0.898。值得强调的是，这种基于GP73的肝脏炎症诊断模型的曲线下面积在ALT不升高（即ALT<40）的CHB患者中能达到0.873，且诊断效能稳定[7]。同期发表的国内另外一项研究也显示，血清GP73是一个肝脏炎症损伤的指标，特别在ALT＜2 ULN的患者中，GP73对于中度以上炎症活动度诊断ROC曲线下面积可达0.806[8]。据此我们建议，未来应开展更多的临床研究，在进一步完善GP73的肝硬化诊断应用的同时，优化基于GP73的肝脏炎症诊断模型，为ALT不升高的CHB患者肝脏炎症精准鉴别提供无创诊断手段。
为进一步验证GP73升高与肝脏炎症活动度有关，我们的研究中纳入了一个抗病毒治疗纵向研究队列。对该组患者进行连续血清学检测发现，随着抗病毒治疗后肝脏炎症的有效控制，血清GP73水平和ALT一样明显下降，但GP73的下降在时相上略有延迟[7]。这或许间接支持了我们的观点，GP73是一个肝脏再生修复指标，即：肝脏炎症损伤致ALT从肝细胞释放入血；为修复损伤的肝组织，残存肝细胞GP73表达随即增加，参与代偿性肝再生的启动，相对应血清GP73水平升高[9]；随着病毒复制被抑制，肝脏的炎症得到改善，伴随肝细胞损伤的缓解，ALT随即复常，肝细胞再生也随着肝脏的修复而停止，不再需要GP73高表达以促进肝细胞增殖，血清GP73也随即复常。我们在该研究中也发现具有促炎和促肝细胞再生修复作用的白细胞介素6能够转录激活GP73的表达。近期王建设团队还探索了GP73测定在儿童不同病因肝病中的诊断应用，以肝穿刺病理学诊断为金标准，在3岁以下儿童中GP73与肝脏纤维化程度及炎症活动度具有相关性。以临床使用的肝硬化诊断模型APRI为对照，GP73对于3岁以下儿童的中度以上肝纤维化的诊断能力优于APRI[10]。
（二）用于抗病毒治疗疗效监测和评估的新型标志物及其临床应用
我们前期研究发现，慢性HBV感染者血清中除了Dane颗粒外，还存在HBV RNA病毒样颗粒（图2）[11]。HBV RNA病毒样颗粒中含有HBV前基因组RNA（pgRNA），在NAs抗病毒治疗下其水平能更好地反映肝细胞内cccDNA的存在及转录活跃状态[12]。据此我们推测，NAs抗病毒治疗时血清HBVDNA和HBV RNA的同时持续消失（低于检测下限）是真正的病毒学应答[13]。而且，HBV RNA在HBV DNA消失后很长一段时间内仍可以被检测到[14]，联合HBV DNA和HBV RNA的总核酸检测也更能反映cccDNA的活性[15]；张文宏团队的工作更显示了抗病毒治疗下患者血清HBV RNA水平与肝脏炎症损伤的相关性[12]。因此，研制HBV DNA和HBV RNA的联合检测具有显著的临床意义。
图2 CHB患者血清中存在HBV RNA样病毒颗粒[11,16]
CHB患者抗病毒治疗的理想治疗终点是“临床治愈”，即血清HBsAg消失，伴有或不伴有抗-HBs阳转。但很多研究都发现，长期用药、尤其是当HBeAg转阴后，血清HBsAg与cccDNA相关性显著下降，且低水平HBsAg阳性并不能证明肝脏内仍有cccDNA存在[17]。对于这一现象，目前较为公认的解释是整合于宿主基因组上的HBV DNA片段也能转录产生HBsAg[18]。因此，临床上亟需新的能真实反映肝组织cccDNA消失或静默的指标，以判定接受延长巩固治疗的患者是否已经获得“病毒学治愈”。可靠的cccDNA检测技术对于判定CHB的病毒学治愈至关重要。目前，精准cccDNA检测的最大挑战是如何排除松弛环状双链DNA（rcDNA）的干扰。由于cccDNA是转录产生pgRNA的唯一来源，而pgRNA又是逆转录合成病毒rcDNA负链的唯一模板，所以rcDNA的存在不仅间接反映了cccDNA的存在，更提示其处于转录活跃状态。据此我们认为，在检测患者肝组织内是否存在有感染潜能的病毒核酸时，并不需要区分rcDNA和cccDNA。但考虑到慢性HBV感染中整合病毒DNA的普遍存在，有必要建立一种能有效区分有病毒复制能力的rcDNA/cccDNA与无复制能力的整合HBV DNA的检测技术。我们前期研究发现，整合HBV DNA片段的断端主要集中在HBV直接重复区（direct repeat，DR）1和DR2附近[19]，也是HBV 基因组的缺口（Gap）区1592～1826附近，整合片段断端的这一特征与双链线性DNA是HBV整合主要来源的报导相一致。基于整合HBV DNA片段的这些特征，我们建立了一对单跨rcDNA缺口引物，使之能有效扩增rcDNA或cccDNA，但由于两引物在整合的线性HBV DNA片段上的方向相反，故不能扩增整合HBV片段[20]。
血清HBV核心抗原相关抗原（HBcrAg）包括HBeAg、HBcAg以及分子量为22 kDa的前核心蛋白p22cr，与HBV RNA一样，只能来源于pgRNA，而pgRNA只能从cccDNA转录而来，因此HBcrAg能反映肝组织内cccDNA的水平和转录活性，且两者具有很强的相关性[21]。此外，NAs不能直接作用于HBcrAg，所以HBV DNA低于检测下限后，HBcrAg仍可被检测。徐东平团队的最新研究发现了抗病毒治疗时代患者血清中HBV DNA、HBV RNA、HBcrAg和HBsAg等指标的动态变化规律（图3）[14]。目前困惑在于，现有HBcrAg试剂盒的检出下限却显著高于HBeAg检测试剂。
图3 NAs治疗下患者血清HBV DNA、RNA、HBcrAg和HBsAg动态变化示意图[14]
需要强调的是，尽管我们和其他实验室的研究结果共同提示，HBV RNA和HBcrAg是目前比较理想的反映cccDNA转录活性的血清学指标，可以很好地用于CHB患者抗病毒治疗HBV DNA低于检测下限后的病毒学应答的监测。但血清HBV RNA和HBcrAg是否可作为评估停药风险的指标，尚缺乏进一步的研究。另外还需要注意，对长期接受抗病毒治疗的CHB患者判定其是否达到病毒学治愈时，只有在这些患者血清中有关HBV的病原学指标均低于检测下限时[LH1] [曾2] ，才有行肝脏穿刺术进行肝组织cccDNA检测的必要。另外，肝穿刺活检cccDNA检测也可用于隐匿性HBV感染的诊断。
综上所述，我们建议：（1）考虑增加抗-HBc定量和血清GP73测定，以在非常规肝穿刺活检的情况下，使有明显肝脏炎症损伤的患者得到及时的抗病毒治疗，减少肝硬化终末期肝病发生；另一方面，对于正在接受NAs药物抗病毒治疗的患者，在灵敏试剂检测血清HBVDNA低于检测下限后，应加测HBVRNA或HBcrAg，以对处于巩固治疗阶段的患者病毒学应答进行监测，并评估巩固治疗后的停药风险等。作为曾经的HBV感染高流行国家，我们在通过乙型肝炎疫苗预防接种已有效减少新发感染的同时，对确诊需要治疗的CHB患者进行精准的干预治疗，以减少终末期肝病的发生。
文章来源：《肝脏》杂志第5期
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