十种中药植物雌激素样作用及其机制的研究

雌激素(estrogen)是女性体内关键性的调节激素，不仅对女性生殖系统的生长、发育、分化有重要的调控作用，而且对骨骼系统、心血管系统、中枢神经系统的正常功能也有重要影响。女性进入绝经期后，随着卵巢功能的衰退和体内雌激素水平的下降，女性将出现更年期综合征，骨质疏松、心血管疾病、老年性痴呆等疾病的发病率也随之上升；而雌激素替代疗法(estrogen replacement therapy，ERT)虽然可明显缓解上述更年期症状，但长期应用雌激素易产生高血凝状态、高血压、水肿、痴呆等副作用，并增加乳腺癌及子宫内膜癌等妇科肿瘤的发病危险。因此，人们一直致力于寻求雌激素替代物，期望这种替代物既能发挥雌激素对心脑血管等系统的保护作用，缓解更年期综合症；同时又能避免上述副作用，植物雌激素(phytoestrogen)正是其中的重要一类。 植物雌激素是天然存在于一些植物中、具有雌激素效能的化合物。因与雌激素结构类似，这些化合物可以与体内雌激素受体(estrogen receptor，ER)结合并显示雌激素样活性。植物雌激素在体内具有双向调节作用：在体内雌激素水平较低时有拟雌激素作用；当体内雌激素水平较高时可发挥抗雌激素活性。因此，近年来植物雌激素又被称为“选择性雌激素受体调节剂”(selective estrogen receptor modulators，SERMs)。 长期以来，许多中草药植物被广泛应用于妇女保健和妇科病症的治疗，这些中药所含的植物雌激素在其中发挥的药效作用不容忽视。在含有植物雌激素成分的中药中，活血化瘀类和补益类中药居各类中药的前二位。本研究选取了其中的十种中药及其所含的部分活性成分作为研究对象，利用整体动物实验、体外细胞培养并结合报告基因检测技术观察比较了它们的植物雌激素样作用，探讨了其可能的作用机制及其影响因素；为妇科临床用药提供实验基础，为更年期妇女保健提供理论依据。 现将论文的主要研究内容和结果简介如下： 1、利用小鼠子宫增重法对十种妇科常用中药(川牛膝、红花、丹参、女贞子、枸杞、甘草、肉苁蓉、淫羊藿、补骨脂和菟丝子)进行雌激素样作用的筛选 通过观察用药前后小鼠子宫系数和体重变化情况，评价淫羊藿等十种中药的雌激素样作用；并利用Elisa法测定血清E_2、FSH、LH水平的变化，免疫组化法检测小鼠子宫组织ERα和ERβ的表达情况。 结果：(1)灌胃淫羊藿可使小鼠的子宫系数和体重增长速度明显升高；灌胃枸杞可促进小鼠体重增长加速。灌胃肉苁蓉和补骨脂可使动物的子宫系数和体重增长速度有所下降；统计学分析表明均有显著性差异(P＜0.01)。(2)红花可显著降低雌激素导致的性未成熟小鼠子宫系数的增高，其他药物的拮抗作用较弱；补骨脂具有显著的协同作用。枸杞和甘草组体重增幅较阳性对照组下降幅度明显。(3)己烯雌酚可诱导小鼠子宫不同部位ERα和ERβ表达的增强，红花、川牛膝、丹参、女贞子、甘草、肉苁蓉、淫羊藿、补骨脂、菟丝子等中药也可影响ERα和／或ERβ的表达。(4)灌胃己烯雌酚可致小鼠血清E_2含量增加，并使LH、FSH含量下降。灌胃菟丝子、红花、丹参和肉苁蓉可使小鼠血清E_2和LH含量增高，FSH含量降低。而灌胃淫羊藿、女贞子、川牛膝使小鼠血清E_2、LH和FSH含量均降低。 2、MCF7细胞增殖实验评价红花等十种中药的植物雌激素活性 利用ER阳性MCF7细胞，单独灌胃中药免煎剂或同时灌胃己烯雌酚和中药免煎剂，以MTT法检测红花、川牛膝、丹参、女贞子、枸杞、甘草、肉苁蓉、淫羊藿、补骨脂、菟丝子等十味中药含药血清对细胞增殖的影响；评价十味中药的植物雌激素活性。 结果：红花、川牛膝、丹参、枸杞、肉苁蓉、淫羊藿、补骨脂和菟丝子等中药含药血清可显著促进MCF7细胞增殖；而女贞子组可见细胞增殖受到明显抑制。在拮抗实验中，红花、川牛膝、丹参、甘草、淫羊藿、补骨脂和菟丝子组可见己烯雌酚促细胞增殖的作用受到了显著抑制；而肉苁蓉可协同并显著增强己烯雌酚促细胞增殖的作用。 3、补骨脂等五种中药植物雌激素活性的实验研究 利用大鼠子宫增重实验及检测含药血清影响ER阳性MCF7细胞增殖的方法评价五种中药的植物雌激素活性。 结果：(1)灌胃补骨脂、川牛膝能明显增加大鼠的子宫系数(p＜0.01)；同时灌胃补骨脂、川牛膝、红花可使阳性药物引起的大鼠子宫系数的升高受到显著抑制(p＜0.01)；(2)补骨脂、川牛膝、丹参组均可见MCF7细胞增殖加速(p＜0.01)，加入ERB协同剂DPN可减弱其促增殖效应；在拮抗实验中，川牛膝、红花、丹参组对细胞增殖的促进作用较阳性对照组有显著性下降，加入ERβ协同剂DPN可进一步加强其下降效应；(3)补骨脂、川牛膝、丹参、菟丝子组均可见细胞增殖指数明显提高；各中药拮抗组对阳性药物引起的细胞增殖指数的增加均无明显的拮抗作用。 4、四种中药和六种中药活性成分植物雌激素作用的比较研究 采用MTT细胞增殖实验观察四种中药：川牛膝、红花、丹参、补骨脂及其所含六种活性成分：蜕皮甾酮、红花黄色素A、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、补骨脂素、异补骨脂素对雌激素受体阳性细胞MCF7增殖的影响，并以雌激素受体拮抗剂ICI182，780干预，探讨其发挥雌激素样作用的可能机制。 结果：川牛膝、红花、补骨脂等四种中药免煎剂能够促进MCF7细胞增殖，其所含四种活性成分：蜕皮甾酮、红花黄色素A、补骨脂素、异补骨脂素能够促进MCF7细胞增殖，并将细胞周期由G1期向S期推进，促进DNA合成，提高细胞分裂增殖指数。同时，加入ER拮抗剂ICI182，780可抑制其促增殖作用。中药丹参对MCF7细胞增殖无明显影响；但其两种活性成分丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA能够抑制MCF7细胞增殖，但对细胞周期影响不显著。同时，加入ER拮抗剂ICI182，780可减弱其对MCF7增殖的抑制作用。 5、异补骨脂素和蜕皮甾酮对人乳腺癌T47D细胞增殖及ER亚型、pS2、PR表达的影响 利用人乳腺癌T47D细胞观察异补骨脂素和蜕皮甾酮对雌激素受体阳性细胞T47D增殖的作用，并检测其对T47D细胞雌激素受体亚型ER-α、ER-β和雌激素效应基因pS2及PR表达的影响。 结果：10~(-5)mol·L~(-1)～10~(-7)mol·L~(-1)异补骨脂素和蜕皮甾酮能够显著促进T47D细胞增殖；10~(-6)mol·L~(-1)和10~(-7)mol·L~(-1)异补骨脂素和蜕皮甾酮可提高细胞分裂增殖指数，表现出雌激素样作用；RT-PCR结果显示：10~(-6)mol·L~(-1)和10~(-7)mol·L~(-1)异补骨脂素和蜕皮甾酮均可使ER-αmRNA表达显著增加，异补骨脂素同时也可提高ER-βmRNA表达；10~(-6)mol·L~(-1)异补骨脂素和蜕皮甾酮还可明显提高雌激素效应基因pS2 mRNA表达；两种药物在一定浓度下均可提高PR表达水平。 6、补骨脂素的植物雌激素作用及其机制的探讨 利用人乳腺癌T47D细胞观察补骨脂素的雌激素样作用，并探讨其可能的作用机制。具体方法为：利用MTT细胞增殖实验观察补骨脂素对ERα、ERβ阳性细胞T47D增殖的影响；以半定量RT-PCR法检测其对该细胞雌激素效应基因：孕激素受体(PR)mRNA表达情况的影响。同时，以雌激素受体拮抗剂ICI182，780为工具药进行干预；并通过流式细胞术检测细胞ERα、ERβ、PR含量的变化。 结果：10~(-5)mol·L~(-1)～10~(-7)mol·L~(-1)补骨脂素能够显著促进T47D细胞增殖；RT-PCR结果显示：10~(-6)mol·L~(-1)和10~(-7)mol·L~(-1)补骨脂素可使PR mRNA表达显著增加，表现出雌激素样作用，而且以上效应均可被ICI182，780拮抗。10~(-6)mol·L~(-1)和10~(-7)mol·L~(-1)补骨脂素还可诱导T47D细胞ER-α、ER-β、PR表达明显增加。 7、基于报告基因方法对中药活性成分植物雌激素作用的比较研究 通过重组荧光素酶报告基因技术比较研究蜕皮甾酮、补骨脂素、异补骨脂素的植物雌激素作用及其可能机制。 结果：无论通过ERα或ERβ介导，一定浓度的蜕皮甾酮、补骨脂素、异补骨脂素均能够诱导报告基因luc的表达(P＜0.01)。但与雌激素(通过ERα或ERβ介导时EC50值分别为5.91×10~(-11)M和6.17×10~(-11)M)比较，蜕皮甾酮、补骨脂素、异补骨脂素的EC50值均显著大于雌激素；同时，加入雌激素受体拮抗剂ICI182，780可明显抑制报告基因表达。 结论： 1、整体动物实验结果显示：实验检测的十种中药均具有一定的植物雌激素活性或抗雌激素活性；但其作用靶器官、作用强度和途径有所差异。 2、对药物血清的雌激素活性进行检测时发现：红花、川牛膝、丹参、淫羊藿、补骨脂、菟丝子等六种中药在单独用药时均表现出拟雌激素作用，在与雌激素同时用药时表现抗雌激素作用；其双向调节效应依赖于体内雌激素水平的高低。 3、中药川牛膝、红花、补骨脂、丹参及其活性成分：蜕皮甾酮、红花黄色素A、补骨脂素、异补骨脂素能够促进ER(+)MCF7细胞增殖，而丹参的两种活性成分：丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA可抑制MCF7细胞增殖，其作用均是通过ER介导的。 4、异补骨脂素和蜕皮甾酮可促进ER(+)T47D细胞增殖，并可影响靶细胞ER亚型、pS2的mRNA表达水平和ER亚型、PR蛋白的表达；异补骨脂素和蜕皮甾酮具有植物雌激素作用。 5、补骨脂素可促进ER(+)T47D细胞增殖，增强ER亚型和PR的表达，且其作用可被ICI182，780拮抗；补骨脂素具有植物雌激素作用。 6、重组荧光素酶报告基因实验证明：蜕皮甾酮、补骨脂素、异补骨脂素均具有植物雌激素样作用，但其作用强度明显低于雌激素，且它们对ERβ的亲和力大于ERα。