Science子刊：​天然杀手γδ T细胞或可绕开CAR-T的强直信号和脱靶毒性丨医麦猛爆料​

2019年9月14日/医麦客 eMedClub/--嵌合抗原受体(CAR)的问世代表了癌症治疗的一项重大技术进步，CAR重定向效应T细胞，使其以不依赖于主要组织相容性复合物(MHC)的方式对细胞表面抗原起反应。这种合成形式的免疫治疗能够有效地对抗免疫“冷”肿瘤，在B细胞恶性肿瘤中取得了令人鼓舞的成功。

两大挑战：强直信号和脱靶毒性

CAR分子包含胞外域和胞内域，胞外域通常是针对细胞表面抗原的单链抗体片段(scFv)，而胞内域包含信号转导结构域。最受欢迎的胞内域配置使用CD3ζ链结合一个或多个共刺激信号域，如CD28或4-1BB等。

当激活时，除了T细胞活化所需的共刺激外，CAR还通过CD3ζ提供相当于T细胞受体(TCR)的信号。CAR中包含的胞外域和共刺激性胞内域的特定组合影响CAR-T细胞的表型和寿命，并且其相对功效与下游信号分子中不同的磷酸化动力学有关。

CAR的两个主要局限性已经显现出来，特别是随着该领域发展到针对更具挑战性的实体瘤。首先，基于单一抗体的CAR不能区分表达靶抗原的肿瘤和健康细胞，这提高了肿瘤脱靶(on-target/off-tumor)毒性的风险。其次，CAR-T细胞的效力可受限于抗原非依赖性(强直)信号传导，其是导致T细胞衰竭的常见原因。

因此微调CAR信号的能力对于最小化强直信号并克服这些限制至关重要。然而，无论是在细胞体外生成和扩增，还是在遇到肿瘤后，都缺乏对CAR-T信号的详细机制分析。

最近的综述倾向于研究新型抗原和联合治疗，但如果不了解CAR的基本信号机制和行为，改变抗原本身可能并不能提供多少优势。

最新研究破译端倪

诸如质谱流式细胞技术(Mass Cytometry)等技术可以在单细胞分辨率下测量多个分子表位，因此具有阐明CAR-T细胞信号传导动力学的潜力。

近日，发表在Science Signaling的一篇论文将重点放在CAR-T领域长期存在的挑战 - 强直信号和脱靶毒性。来自伦敦大学学院大奥蒙德街儿童健康研究所等机构的研究人员使用质谱流式细胞技术分析CAR-T细胞，结果发现：在CAR-T细胞扩增过程中，αβT细胞数增加的同时，强直信号也会增加；相反，γδT细胞的扩增不会改变其本身的基础活性。另外，当这些γδT细胞被工程化以表达嵌合共刺激受体(CCR)时，它们可以特异性地识别恶性骨髓细胞靶标。

• CD3ζ是第二代CAR强直信号传导的来源

CAR强直信号在一定程度上是由寡聚化引起的，可归因于scFv结构域的交互作用。一种被认为是强直信号传导的后遗症是T细胞衰竭，这一因素与CAR-T细胞产品的临床疗效较差有关，并与PD-1和TIM-3等T细胞衰竭标志物的表达有关。

对具有三种不同抗原识别结构域的CAR的分析表明，CD3ζ模块(而不是CD28)是第二代CAR强直信号传导的来源。

与连续刺激的公认结果一致，该研究发现表达三种第二代(28ζ)CAR中的T细胞比未转导的细胞表达更多PD-1和TIM-3。然而，尽管含有不同抗原靶向的scFv，不同CAR-T细胞上这些标志物的丰度没有差异，这表明28ζ CAR的耗尽可能与scFv同一性无关。

• CCR-γδT细胞有望解决挑战

进一步，由于来自28ζ CAR的过量和冗余CD3ζ信号是无法改变的，该研究测试了替代CAR设计以避免强直信号导致的T细胞衰竭；有研究表明，去除三种CD3ζ ITAM(免疫受体酪氨酸活化基序)中的一种或两种促使CAR-T细胞的体内持久性增强，而不降低功效。

以γδT细胞为基础，研究人员可以选择去除合成CD3ζ信号传导基序。

经常被忽视的肿瘤浸润性γδT细胞是实体肿瘤阳性结果的最强预测因子。这些细胞容易接受常规CAR和CCR，而不丧失先天功能或肿瘤向性。与αβT细胞相比，γδT细胞上的天然γδTCR本身可用于提供CD3ζ信号，由于不依赖于CAR来传递CD3ζ信号，强直信号有望得到限制。

TCR-T根据表达的TCR类型，可分为αβ TCR和γδ TCR：

（1）αβT细胞分布广泛，识别抗原具有MHC限制性，既可分化为辅助性T细胞(Th)也可分化为细胞毒性T细胞(CTL)。αβTCR是利用α和β肽链构成的异元二聚体来识别由主要组织相容性复合体(MHC)呈现在细胞表面的多肽片段。值得注意的是，MHC分子能够呈现从细胞表面和细胞内蛋白中获得的肽链，也就是说αβ TCR-T，能够靶向细胞内外的多种抗原。

然而，αβ TCR-T细胞也具有一定的局限性，主要是低亲和力、需要特定的HLA配型、MHC限制以及与内源α/β TCR链配对后介导自身反应性的风险。

（2）γδT细胞数量较少，约占人类外周血淋巴细胞的1％-10％，发挥免疫监视作用。γδT细胞作为身体的第一道防线之一，它们具有靶向和破坏癌细胞和感染细胞的固有能力。

与αβT细胞不同，一旦γδT细胞识别出生理自身的改变，它们就能非常快速地响应而不需要通过抗原呈递细胞引发或淋巴系统中的克隆扩增。它们可以立即杀死转化或感染的细胞，吸引常规的适应性免疫系统或自身呈递抗原，以便开始完全发展的全身免疫应答。通过感应癌细胞特异性表达的应激信号，γδTCR可以将癌细胞与健康细胞区分开。

基于NKG2D在γδT细胞活化及其对肿瘤免疫逃逸机制的易感性，研究人员设计了一种DAP10-CCR(嵌合共刺激受体)修饰的γδT细胞。

NKG2D是由一系列效应淋巴细胞表达的先天免疫受体，包括Vδ2+γδT细胞，其响应危险相关的分子标志物如MICA、MICB和ULBP1至ULBP6。它在γδT细胞活化中的作用仍然存在争议; 一些研究表明它可以作为共刺激分子，其他研究表明NKG2D单独足以激活γδT细胞。NKG2D不含任何信号传导的内部结构域，而是与衔接蛋白DAP10形成复合物。DAP10的参与促进PI3K活化和SLP-76磷酸化。

结果发现，尽管使用与28ζ CAR相同的胞外域，但在γδT细胞中表达的CCR减少了与CD3ζ信号传导结构域相关的强直信号，并且表现出AND门的特征 –  CCR的激活需要共刺激信号和γδTCR提供CD3ζ信号，由于γδTCR可以排除健康细胞，可能引起较少的脱靶毒性。

▲ CCR的激活需要共刺激信号和γδTCR提供CD3ζ信号（图片来源：Science Signaling）

另外，有可能是因为细胞内堆积或NKG2D/DAP10复合物和DAP10-CCR的量的差异，合成受体的刺激产生更有效的信号，并激活未被NKG2D刺激激活的p38 MAPK和MEK途径。

重要的是，CCR-γδT细胞激活仅在刺激CCR时观察到，表明信号传导的可塑性得到保持并且对γδT细胞耗尽曲线没有影响。

• CCR-γδT特异性地识别恶性骨髓细胞

癌症免疫治疗策略必须在疗效和毒性之间取得平衡。在针对淋巴恶性肿瘤的CAR-T试验中，健康CD19+细胞的耗竭是一种公认但可容忍的副作用。

而在急性髓系白血病(AML)的病例中，如果CAR-T细胞持续存在于患者体内，则表达CD33-28ζCAR的T细胞消融健康的骨髓细胞可能具有极大的毒性。

在体外，最新研究证明CD33-DAP10增强Vδ2+ γδT细胞的功能，与用AML细胞培养的未转导细胞相比具有显著的增殖优势。CD33-DAP10 Vδ2细胞也能够杀死AML细胞，而不表现出对同种异体单核细胞或骨髓祖细胞的毒性。

利用γδT细胞的抗癌能力

天然杀手γδT细胞是先天免疫系统的一部分，具有极大的抗癌潜力。目前，已有一些公司正在开发γδT细胞疗法以对抗癌症，包括TC Biopharm和GammaDelta Therapeutics、Gadeta。

→ 2019年4月，TC BioPharm(简称：TCB)宣布已启动OmnImmune®(TCB002)的I期临床研究(NCT03790072)，这是一种同种异体细胞疗法，由活化和扩增的γδ T细胞组成。

TCB还使用γδ T细胞作为CAR技术的平台，利用它们对仅由癌细胞和感染的细胞表达的磷酸化抗原的先天特异性来开发Co-stim CAR。内源性γδ TCR与CAR-T的高亲和力结合物结合；Co-stim CAR编码常规CAR的截短形式，其中不含CD3ζ活化信号组分。合理的设计使Co-stim CAR仅在γδ TCR同时激活时才提供激活信号。

2017年12月，该公司与Bluebird达成了一项关于γδ CAR-T细胞疗法的战略合作和许可协议。两家公司将共同合作，推进TCB公司领先的CAR设计的γδT细胞项目进入临床。

→ 2018年7月，Kite Pharma宣布与荷兰的生物技术公司Gadeta签订协议，合作开发后者的γδTCR技术的新型癌症免疫疗法。Gadeta似乎是唯一一家将γδT细胞的γδTCR与αβT细胞结合为一体的公司。目前，该公司在研产品仍处于临床前阶段，但正准备在2020年进行一项针对实体瘤的关键的临床研究。

→ 英国的新星生物技术公司Gamma Delta Therapeutics，其新型T细胞平台也是基于来自人组织的γδT细胞的特殊性质开发而来。日本武田制药也就其新型T细胞平台开发与其达成了一项战略合作协议。

结语

基于γδTCR的细胞疗法仍然有待探索，不管是CAR-T还是TCR-T的开发仍在早期，属于小众领域，但最新的研究证实了其潜力。

针对CAR-T领域现存挑战，如果无法扭转由结构本身介导的强直信号，那么可能需要针对CAR结构本身做出相应的改变，如文中使用的CCR γδT细胞。