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CAR-T细胞免疫疗法在实体瘤的疗效远不及血液肿瘤，重要原因是实体瘤的免疫抑制微环境可阻止T细胞的浸润、活化、扩增。肿瘤微环境中免疫抑制主要包括两种作用机制：T细胞受体（TCR）信号通路的失活和炎症因子的消耗[1-2]。
虽然全身应用大剂量细胞因子，如白介素-2（IL-2），可以显著增强T细胞抗肿瘤活性，但这也会引起严重且常见的毒性反应——毛细血管渗漏综合征，最终导致多器官功能失调[3]。
因此，如何局部、直接递送细胞因子到肿瘤微环境，从而避免全身细胞因子毒性，是研究人员面临的难题。
近日，由加州大学旧金山分校细胞设计研究所的Wendell A. Lim教授领衔的研究团队，成功解决了这一难题[4]。
他们在CAR-T细胞上安装了肿瘤抗原特异性激活的Notch受体（synNotch），该受体激活后，可使CAR-T细胞合成并自分泌细胞因子IL-2，从而形成靶向肿瘤的IL-2局部递送环路，有效地克服了肿瘤微环境的免疫抑制，CAR-T细胞得以浸润、活化、扩增，并清除实体肿瘤，同时最小化IL-2的全身毒性。这项重要研究成果发表在著名期刊《科学》杂志上[4]。
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基于课题组既往的研究成果[5-6]，Wendell A. Lim团队首先设计了一个胞外段靶向结合肿瘤特异性抗原。
随后引起胞内段酶切入核转录合成IL-2的synNotch受体，这个通用型的synNotch受体可根据需要改变胞外段识别的抗原信号和胞内段转录的目标基因，命名原则为anti-sensor synNotch→target gene，如anti-CD19 synNotch→sIL-2（亲和力更强的超级IL-2）。
synNotch受体的原理
既往的CAR或TCR-T细胞疗法在结合肿瘤抗原并激活后，才能合成IL-2等细胞因子，但免疫抑制性肿瘤微环境限制了CAR或TCR的激活。synNotch受体使工程化的T细胞以CAR或TCR非依赖方式，绕开了这一主要的肿瘤免疫抑制机制。
同时，免疫抑制性肿瘤微环境还具有IL-2合成不足和过度消耗的特点，如调节性T细胞、原始T细胞竞争性消耗IL-2。因此，synNotch受体激活后合成的IL-2有效地提升了肿瘤内IL-2浓度，克服了另一主要的肿瘤免疫抑制机制。
体外试验表明，在相应抗原信号存在的情况下，synNotch受体有效合成sIL-2，并自分泌促进无CAR或TCR活性的工程化T细胞的增殖，或旁分泌促进共培养的非工程化的T细胞或NK细胞的增殖。
synNotch受体的体外活性
免疫缺陷型小鼠的体内试验表明，含有synNotch受体的工程化T细胞仅靶向作用于表达相应抗原信号的肿瘤，产生synNotch活化、T细胞扩增，而无脱靶效应。
当同时在工程化T细胞上安装有活性的TCR受体（自分泌IL-2）、或同时注射有TCR活性的T细胞（旁分泌IL-2），synNotch受体的增殖信号与TCR受体的活化信号共同打开肿瘤杀伤的门控开关。
免疫缺陷型小鼠内，synNotch受体的体内活性和与TCR受体组成的肿瘤杀伤门控开关（AND gate）
但是，免疫正常的小鼠体内存在多种抑制IL-2生成和增加IL-2消耗的因素，这可能是CAR-T细胞免疫治疗临床试验难以复现体外实验、免疫缺陷小鼠等临床前研究的抗肿瘤活性的重要原因[7]。
的确，这一CAR-T技术在免疫正常的小鼠上的表现与免疫缺陷型小鼠不完全相同。研究团队选取了免疫抑制性的小鼠胰腺导管腺癌模型，该模型表达Mesothelin肿瘤抗原，并被导入人CD19抗原，也就是synNotch识别的抗原。
他们发现只有把anti-CD19 synNotch→mIL-2（小鼠IL-2）受体与anti-Mesothelin CAR受体安装在同一个T细胞上（自分泌IL-2），才能够有效清除免疫正常小鼠体内的肿瘤；而把这两个受体分别安装在两个T细胞上（旁分泌IL-2），混合注入免疫正常小鼠体内则不能清除肿瘤。免疫抑制性黑色素瘤模型具有相似表现。
免疫正常小鼠内，只有把synNotch受体与CAR受体安装在同一个T细胞上才能清除肿瘤
对于此差异，Wendell A. Lim团队认为，由肿瘤抗原条件性激活的局部细胞因子自分泌环路起到了关键作用。研究团队通过对比CAR-T细胞联合大剂量全身IL-2、组成性持续表达IL-2的CAR-T细胞、由CAR激活的条件性表达IL-2的CAR-T细胞，证实了这一假设。
具体而言，全身应用大剂量IL-2引起强烈的全身毒性；组成性持续表达IL-2引起IL-2的基因沉默，可能原因是IL-2的双相作用，长时间持续的IL-2作用加速了激活诱导的T细胞终末分化和死亡；由CAR激活的条件性表达IL-2，因与CAR共用一个肿瘤抗原信号，特异性减低，使CAR-T细胞产生严重的针对正常组织的靶向毒性（on-target/off-tumor toxicity）。而由两个不同肿瘤抗原信号分别激活synNotch受体和CAR受体则大大提高了肿瘤靶向特异性，有效避免了上述其他IL-2递送方法的缺陷。
所以，重要的不仅是给不给细胞因子，还包括什么时间给、什么空间给、给的方式、给多少等，还得能够实时感应、动态调节。
最后，研究团队研究了带有自分泌synNotch→IL-2环路的CAR-T细胞是如何清除肿瘤的。
肿瘤切片染色显示，带有自分泌IL-2环路的CAR-T细胞广泛浸润整个肿瘤；而普通CAR-T细胞只存在于肿瘤外周，无法浸润到免疫排斥型肿瘤内部。
带有自分泌synNotch→IL-2环路的CAR-T细胞广泛浸润到免疫抑制性肿瘤内，普通CAR-T细胞则不能
流式细胞术显示，自分泌IL-2的CAR-T细胞促进CAR-T细胞和小鼠自身T细胞的浸润，而旁分泌IL-2的CAR-T细胞（synNotch受体和CAR受体分别安装在两个T细胞上）只促进小鼠自身T细胞的浸润，可能的原因是小鼠自身的T细胞相比输注的CAR-T细胞数量庞大，竞争性消耗了肿瘤微环境中的IL-2。
质谱流式功能分析显示，只有浸润的自分泌IL-2的CAR-T细胞表现出活化、杀伤效应、增殖活性，且无耗竭表现；而浸润的小鼠自身的T细胞在活化、杀伤效应、增殖、耗竭等方面均无改变，起到大量消耗IL-2的作用而无抗肿瘤活性，并且小鼠自身T细胞相比CAR-T细胞数量庞大且源源不断，这可能是旁分泌IL-2被“截胡”的主要原因。另外，肿瘤微环境中髓系来源的免疫抑制性细胞功能也没有发生变化。
总体来说，Wendell A. Lim教授领衔的研究团队设计的肿瘤抗原特异性激活的自分泌细胞因子（synNotch→IL-2）环路，不是通过改变免疫抑制性微环境，而是通过巧妙地绕过免疫抑制性微环境的两个关键步骤（TCR信号通路的失活和IL-2等细胞因子的消耗），实现CAR-T细胞对肿瘤的杀伤，同时避免IL-2的全身毒性及CAR-T的脱靶效应。
肿瘤抗原特异性激活的自分泌细胞因子（IL-2）环路促使CAR-T细胞绕过免疫抑制性微环境的两个关键步骤而有效杀伤肿瘤
有趣的是，由波士顿大学生物设计中心的Ahmad S. Khalil教授领衔的研究团队，也在同期《科学》上发表了可控制的合成性基因环路研究，该环路可导入原始T细胞，从而有顺序的、有组织的引导T细胞发生增殖、活化，产生抗肿瘤活性[8]。
与Wendell A. Lim团队采用肿瘤特异性抗原激活synNotch→IL-2环路不同，Ahmad S. Khalil团队通过安全且常用的小分子激活合成性锌指转录调控蛋白（synZiFTRs）调控相应靶基因环路的转录。
两种不同方式激活的基因合成环路[9]
总之，期待这些神奇的合成生物学技术能够早日应用于临床，使效果强劲且控制精细的工程化T细胞能够造福广大肿瘤患者。
