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【引用本文】 周文涛，楼文晖. 胰腺神经内分泌肿瘤肝转移分子机制研究进展[J]. 中国实用外科杂志,2019,39(9):976-978.
胰腺神经内分泌肿瘤肝转移分子机制研究进展
周文涛，楼文晖
中国实用外科杂志,2019,39(9):976-978
作者单位：复旦大学附属中山医院普外科，上海200032
通信作者：楼文晖，E-mail：lou.wenhui@zs-hospital.sh.cn 胰腺神经内分泌肿瘤（pancreatic neuroendocrine neoplasms，pNENs）是一类相对罕见的胰岛细胞起源的肿瘤，占所有胰腺肿瘤的1%～2%。pNENs的组织学特征、生物学行为及临床表现具有高度异质性。2018年世界卫生组织（WHO）专家共识建议将pNENs归类为分化好的神经内分泌“瘤”（neuroendocrine tumor，NET）和分化差的神经内分泌“癌”（neuroendocrine carcinoma，NEC），前者根据肿瘤增殖活性（核分裂像及Ki-67）再划分为高（G1）、中（G2）、低（G3）级别NET，后者则依据细胞形态划分为小细胞型和大细胞型NEC［1］。
多数pNENs呈惰性生长，长期随访保持稳定，但部分pNENs病人进展迅速，就诊时已发生转移，少数病人还伴发难以控制的内分泌症状。肝脏是pNENs最常见的转移部位，而一旦出现肝转移，则预后显著变差［2］。Yao等［3］通过分析1988—2004年美国SEER数据库中G1/G2 pNENs病人的生存资料发现，远处转移病人的中位生存期不足27个月，5年、10年存活率仅为27%和11%。目前，pNENs肝转移已成为研究热点，随着分子生物学领域研究的深入，其肝转移机制也逐步被揭示。1 流行病学特征 40%～70%的pNENs病人诊断时伴同时性肝转移，约80%病人的转移灶同时累及肝脏左右叶；对于仅累及单个肝叶者，左右半肝的转移发生率差异无统计学意义。研究发现，存在内分泌症状的功能型pNENs发生同时性肝转移的风险更低。这可能和功能型pNENs病人因激素相关临床症状早期就诊相关；无功能型pNENs病人往往因为症状隐匿，导致其自然病程较长，发现时多数已远处转移。Ye等［4］对78例pNENs进行术后长期随访发现，功能型pNENs病人异时性肝转移发生率仅为5%，远低于无功能型pNENs的34.2%，这表明除了病程长短外，这两类肿瘤自身的生物学行为差异也是影响肝转移的重要因素。来自复旦大学附属中山医院104例pNENs数据回顾性分析显示，功能型及无功能型pNENs病人的总体肝转移发生率分别为7.4%和26.0%［5］。至于各不同功能类型间pNENs肝转移发生率是否存在差异，目前尚无研究报道。肿瘤的增殖活性与肝转移发生率也呈明显正相关，Canellas等［6］分析发现G2/G3 pNENs病人发生同时性肝转移的风险显著高于G1病人，而一项包含124例pNENs肝转移病例的研究也显示，G2、G3病人所占的比例高达92.5%［7］。但对于发生单侧肝叶还是双侧肝叶转移，则与G分级无明显相关性。除上述功能状态和增殖活性外，肿瘤的T分期、细胞分化等也是影响pNENs肝转移的重要因素。 2 肝转移机制 肿瘤的转移涉及一系列复杂、序贯的细胞生物学事件，统称为侵袭-转移级联机制，包括：（1）癌细胞穿透细胞基质及基质细胞层。（2）浸润血管腔。（3）在血流转运中存活。（4）被靶器官捕获。（5）侵入靶器官实质。（6）在新的微环境中存活并形成微转移灶。（7）恢复增殖能力并形成克隆。上皮-间质转换（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是肿瘤细胞获取侵袭能力，开启侵袭-转移级联步骤的始动因素，而肿瘤新生血管的形成则为转移提供丰富的便捷通路。近来的研究提示上述两个机制在pNENs肝转移进程中扮演着重要角色。
2.1 EMT与pNENs肝转移 EMT是上皮细胞丢失细胞间黏附、连接结构获取间质表型进而增强迁移能力的生物学过程，主要由Slug、Snail、Twist、Zeb1/2等转录因子负责调控。E-钙黏素（E-cadherin）是上皮细胞特征性黏附分子，其表达在EMT过程中常被抑制。Fendrich等［8］通过免疫荧光染色首次报道了E-cadherin的表达量、细胞膜定位与Snail的表达呈明显负相关；其后Galvan等［9］在胃肠胰NET组织中验证了上述研究结果。Yonemori等［10］通过对pNENs石蜡样本进行免疫组化染色发现，存在上皮表型（Snail低表达和E-cadherin正常表达）的病人发生肝转移的概率显著低于发生间质表型转化（Snail高表达或E-cadherin低表达）的病人。此外，该研究还发现，对于上皮表型未丢失的病人，即使病理学分级为G2甚至NEC，也均未发生肝转移。Fendrich等［11］在pNENs细胞BON-1中敲低Slug和Snail表达后发现，E-cadherin表达显著上调且细胞间黏附力增强，进一步荧光素酶报告基因实验显示上述转录因子可能通过抑制E-cadherin基因启动子活性而干扰其转录。除E-cadherin的表达调控外，研究显示钙黏素转换也是驱动NET发生EMT的关键分子事件。尽管如此，目前关于EMT在pNENs肝转移机制中的研究多来源于临床样本层面的检测，尚缺乏可靠的体内外实验及深入的分子机制探索。
2.2 新生血管形成与pNENs肝转移 新生血管除给肿瘤组织生长提供营养外，也给肿瘤细胞转移提供了重要通道。pNENs以富血供著称，其微血管密度远高于导管腺癌等其他胰腺实性肿瘤。微环境中肿瘤新生血管形成机制复杂，目前研究多聚焦于血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factors，VEGF）的生物学作用。Couvelard等［12］发现78%的pNENs有VEGF的表达且和微血管密度呈正相关，同时胞质内低氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）含量也与VEGF表达具有明显相关性，提示HIF信号通路可能参与pNENs微血管的形成。Wu等［13］通过体外实验显示RWD结构修饰增强子（RWD containing sumoylation enhancer，RSUME）可通过HIF-1α/VEGF通路调控pNENs血管生成，此外RSUME还利用核因子-κB（nuclear factor κB，NF-κB）/白介素8（interleukin-8，IL-8）信号通路维持VEGF低表达时pNENs形成新生血管的能力。
微血管数目对pNENs转移的影响尚存争论。研究表明高级别pNENs微血管密度较低级别者更低，但前者存在明显的血管结构异常，提示肿瘤血管的结构特征可能是影响pNENs转移更为关键的因素［14］。由于正常血管内皮细胞间存在紧密连接结构，极大降低了肿瘤细胞的浸润效率，故而形成细胞间连接疏松、缺乏周细胞覆盖的高通透性新生微血管是促进肿瘤细胞进入循环系统的重要机制。Eleftheriou等［15］通过敲除pNENs小鼠模型RIP1-TAg2的骨形态发生蛋白9（bone morphogenetic protein 9，BMP9）基因发现，杂合性及纯合性缺失小鼠的肝转移灶数目分别较野生型pNENs小鼠增加了66%及188%。进一步研究表明BMP9基因缺失促使血管内皮细胞发生间质转化，导致细胞间连接变得疏松、微血管通透性明显增加，最终肿瘤细胞更易浸润血管腔而发生远处转移。Detjen等［14］发现血管生成素2（angiopoietin-2，Ang-2）在神经内分泌肿瘤病人血清中的浓度与肝转移风险呈显著正相关，而已有的研究显示Ang-2高表达可导致乳腺癌、肾癌等肿瘤组织中血管周细胞覆盖减少、内皮细胞凋亡增加以及血管功能障碍，提示Ang-2相关的肿瘤血管非成熟化可能是促进pNENs肝转移的另一重要机制。
新生血管在肿瘤转移中扮演的“桥梁”角色给pNENs的抗血管生成治疗提供了一定的伦理依据。Wu等［16］通过构建无功能型pNENs肝转移小鼠模型发现，血管生成抑制剂阿帕替尼、舒尼替尼均能显著减少肝转移的数目和体积，且转移瘤中的血管密度也明显降低。然而，对于胰岛素瘤，上述抗血管治疗反而促进其肝转移，这可能和血管内皮完整性破坏及诱导低氧有关［16］。因此，血管抑制药物在pNENs治疗中的应用还须谨慎。
2.3 其他 近年来，随着测序技术在pNENs检测中的应用增加，越来越多与肝转移相关的分子事件被发现。Gleeson等［17］对32例pNENs肝转移组织进行靶基因测序发现，28%的转移灶存在2个及以上基因突变。Roy等［18］对19例pNENs肝转移灶进行全外显子测序发现了ATRX、DAXX、MEN1、CDKN2A等基因的高频突变。Singhi等［19］通过对52例病人的192个转移灶进行免疫组化染色发现，52%的病例存在上述ATRX/DAXX基因的缺失，且和无病生存期及总生存期减少具有相关性。已有的研究显示，ATRX/DAXX失活突变与端粒替代延长机制（alternative lengthening of telomeres，ALT）明显相关，后者不依赖端粒酶而通过同源重组维持端粒长度，使肿瘤细胞永生化。Kim等［20］发现ATRX/DAXX失活和ALT激活是pNENs发展进程中的一个晚期事件，与血管、神经侵犯及肝转移等侵袭性临床特征显著相关，提示上述基因突变可能是pNENs发生转移的驱动因素。同样，Pea等［21］对87例＜3 cm、分化好的pNENs检测发现，ALT活化是这个相对惰性“亚群”发生肝转移的独立危险因素，且ALT活化合并DAXX突变、染色体增加、拷贝数变异的亚组病人肝转移发生率达到73%，远高于未发生上述分子事件者。此外，Serra等［22］近来发现，50.8%的pNENs病人存在FGFR4基因第388位密码子的错义突变，而携带突变基因病人发生肝转移的风险是野生型病人的6.3倍，进一步的体内实验验证了上述FGFR4突变对pNENs肝转移的促进作用。可见，单个或多个关键基因的重要位点突变可能是触发pNENs肝转移的始动因素。然而，目前pNENs肝转移基因组学的研究多为临床特征相关性分析，至于遗传物质发生改变的原因以及基因组改变后所带来的一系列分子、通路、功能等的变化尚无深入报道。 3 结语 肝脏转移是影响胰腺神经内分泌肿瘤病人长期生存最常见、最重要的危险因素。因此，研究pNENs肝转移机制将给高危病人的筛选、随访以及药物研发、治疗策略制定等提供基础理论支持。随着研究的进展，越来越多pNENs肝转移相关或潜在机制被揭示，诸如EMT、新生血管形成、ALT等，但上述研究大多局限于临床组织样本的检测和分析，鲜有更为深入的体内外功能验证或分子通路研究。目前，造成肝转移机制研究困境的原因主要有如下几方面：（1）罕见性。pNENs的低发病率导致病例积累周期长，尤其要满足统计学上检验效能高的样本量更是十分困难。（2）异质性。pNENs高异质性的特征给基于单一亚型的研究结论的验证和推广带来了巨大挑战。（3）缺乏可靠研究模型。可靠的细胞、动物模型是深入研究pNENs肝转移机制的重要保障，尽管部分研究基于BON-1、QGP-1等人源细胞系阐述了相关转移机制，但这些细胞能否代表全部pNENs的生物学行为尚存疑问；而动物模型方面，目前尚未建立公认的pNENs肝转移模型，即使是pNENs原位模型，也均为功能型神经内分泌肿瘤，无法模拟临床实践。
因此，对于高度异质性的罕见肿瘤的研究，离不开多中心的长期合作，尤其是区域或全国胰腺中心的病例整合和数据分享。另一方面，技术的改进或创新是突破对疾病传统认知的重要手段。近年来，以全外显子、全基因组等为代表的高通量测序技术丰富了我们对pNENs发病机制、进展转归等特征的认识，或许以分子分型为基础的精准分类以及基于特定分子改变的基因工程动物模型的构建将给pNENs肝转移的基础研究和临床治疗带来新的突破。
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