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你真的了解细菌内毒素对注射剂的危害吗？细菌内毒素会导致发热反应，白细胞反应，内毒素休克。 注射剂检测细菌内毒素有两种方法，即凝胶法和光度测定法，供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。本文详细介绍用凝胶法检测细菌内毒素，凝胶法中鲎试剂和内毒素的反应机理如下图所示： 凝固后如下图： 1.方法依据 细菌内毒素检查法-凝胶法（中国药典2015年版四部通则1143 第一法）。 2.实验准备 2.1玻璃器皿 试验用器皿（一般为耐热玻璃器皿）洗净晾干后，放入适宜的密闭金属容器中或用锡箔纸包好后再放入金属容器内，置250℃烤箱恒温30min，以除去外源性内毒素，备用。 注意事项：在不打开金属容器的情况下，可在两天内使用；如果玻璃器皿用锡箔纸包装，在不打开包装的情况下可在两周内使用，否则须再次干烤除去可能存在的外源性内毒素。 2.2塑料器皿 若使用塑料器具，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。 2.3检查用水 应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml，且对内毒素试验无干扰作用。 2.4细菌内毒素标准品 细菌内毒素标准品，用于干扰试验及不同浓度内毒素溶液的制备、鲎试剂灵敏度复核试验。（或者细菌内毒素工作标准品，系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价） 2.5鲎试剂 2.6调pH用试液 如果需要，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲液调节pH值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检査用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。（一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0〜8.0的范围内为宜） 3.内毒素限度及最大稀释倍数（MVD）的确定 3.1内毒素限度的确定 3.2最大有效稀释倍数（MVD）的确定 4.鲎试剂灵敏度复核试验 4.1细菌内毒素标准溶液的制备 取细菌内毒素工作标准品一支，轻弹瓶身，使粉末均落入瓶底，用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，用酒精棉球擦拭后启开，启开过程中应防止玻璃屑落入瓶内。 按照标准品说明书，加入规定量的细菌内毒素，用检查用水溶解，用封口膜将瓶口封严，置涡旋仪上混合15min。然后进行稀释，制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液，即2λ、λ、0.5λ、0.25λ，每稀释一步均应在涡旋仪上混合30s。 4.2复核鲎试剂 取规格为0.1ml/支的鲎试剂18支，轻弹瓶身，使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0.1ml 检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使充分溶解，避免产生气泡。 将已充分溶解的待复核鲎试剂18支放在试管架上，然后从高到低依次加入0.1ml 的2λ、λ、0.5λ、和0.25λ的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另2管加入0.1ml检查用水作为阴性对照，加样方法如下表所示：
加样结束后，将鲎试剂用封口膜封口，轻轻混匀，避免产生气泡，连同试管架放入37℃±1℃水浴或适宜恒温器中，试管架保持水平状态，保温60±2分钟。 4.3观察现象 将试管架从水浴中轻轻取出，避免振动，将每管拿出缓缓倒转180°观察，管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（+）；未形成凝胶或凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为（－）。保温过程和拿取试管过程应避免受到振动，造成假阴性结果。 4.4结果判断 当最大浓度（2λ）4管均为阳性，最低浓度（0.25λ）4管均为阴性，阴性对照管为阴性时，实验为有效，按下式计算反应终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc）。 λc = lg-1 (∑X/4) 式中X为反应终点浓度的对数值（lg）。 反应终点浓度是系列递减的内毒素标准溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。 当λc在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）时判定该批鲎试剂灵敏度复核合格，可用于干扰实验和供试品细菌内毒素检查，并以λ（标示灵敏度）为该批鲎试剂的灵敏度。 注意事项：当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。 5.干扰预试验即求最高无干扰浓度试验 5.1确定供试品最大有效稀释倍数（MVD） 例如：某品种的内毒素限值L为50EU/ml，鲎试剂的标示灵敏度为0.25 EU/ml，则MVD=1.0ml/ml×50EU/ml/0.25 EU/ml=200（倍）。注：例子不涉及具体品种，为计算提供 5.2供试品的稀释 取供试品，用内毒素检查用水将其分步稀释至6.25倍、12.5倍、25倍、50倍、100倍、200倍。 5.3阳性对照溶液 取1支细菌内毒素标准品，用检查用水稀释成浓度为4λ（用于配制供试品阳性对照液）、2λ（阳性对照液）的标准溶液，每稀释一步均应在涡旋仪上混合30s。 5.4加样方法 分别用稀释至6.25倍、12.5倍、25倍、50倍、100倍、200倍的供试品溶液与同体积浓度为4λ的标准溶液混合，得到6.25倍、12.5倍、25倍、50倍、100倍、200倍的均含2λ细菌内毒素溶液，每稀释一步均应在涡旋仪上混合30s。 加样方法如下表：
加样结束后，将鲎试剂用封口膜封口，轻轻混匀，避免产生气泡，连同试管架放入37℃±1℃水浴或适宜恒温器中，试管架保持水平状态，保温60±2分钟。 5.5结果判断 观察现象，当阴性对照为阴性，阳性对照为阳性时，实验有效。 当各稀释倍数浓度中出现供试品溶液2管均为阴性，供试品阳性对照2管均为阳性时，认为供试品在该浓度下不存在干扰，可选用该稀释倍数（例如50倍）进行干扰确认试验； 注意事项：当各稀释倍数浓度中所有浓度的供试品管均不为阴性，或者供试品阳性对照不为阳性时，说明供试品对内毒素与鲎试剂的反应存在干扰，则应该进行更大的稀释倍数，或者通过其他的适宜方法排除干扰。 6.干扰确认试验 检验在某浓度下的供试品对于鲎试剂与内毒素的反应有无干扰作用。验证干扰预试验中所得的合适的稀释倍数（例如50倍）。 6.1供试品的稀释 取本品，用内毒素检查用水将其稀释至25倍（用于制备供试品阳性）、50倍（供试品）。 6.2阳性溶液 取1支细菌内毒素标准品，用检查用水稀释成浓度为4λ（用于配制供试品阳性）、2λ（阳性对照）的标准溶液，每稀释一步均应在涡旋仪上混合30s。 6.3加样方法 用稀释至25倍的供试品溶液与同体积浓度为4λ、2λ、λ、0.5λ的标准溶液混合，得到50倍的含2λ、λ、0.5λ、0.25λ细菌内毒素的供试品溶液，每稀释一步均应在涡旋仪上混合30s。 加样方法如下表所示。
加样结束后，用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，连同试管架放入37±1℃水浴或适宜恒温器中，保温60±2分钟后，观察并记录结果。 6.4实验结果计算 当两组最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，样品阴性对照管和阴性对照管均为阴性时，试验有效。 按下式计算用检查用水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值(Es)和用供试品溶液制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值(Et)。 Es= lg-1 (∑Xs/4) Et= lg-1 (∑Xt/4) 式中，Xs、Xt分别为用检查用水和供试品溶液制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的对数值（lg）。 6.5结果判断 当Es在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ和2.0λ）时，且Et在0.5 Es～2.0Es （包括0.5 Es和2.0Es）时，则认为供试品在该浓度下无干扰作用，可在该浓度下对此供试品进行细菌内毒素检查。当Et不在0.5 Es～2.0Es（包括0.5 Es和2.0Es）时，则认为供试品在该浓度下有干扰作用。 7.验证结论 验证结果表明，将供试品稀释至50倍（浓度为XX）进行干扰试验，供试品在此浓度下对鲎试剂无干扰作用，验证通过。本方法适合于本品的细菌内毒素检查。
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