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测序公司发送的测序结果一般有一个峰图文件和一个序列文件，峰图文件为abi格式，可用chromas软件打开。四种颜色的波形代表四种碱基的信号强度。 正常的峰图，波峰与波谷清晰，峰与峰之间的距离均匀， 比较理想的测序结果在底部应该没有杂峰干扰。  测序结果的前几十bp的数据不太可靠，在拼接序列或序列比对时需要先去除这部分，以免影响分析结果。  测序公司给出的峰图在超过800bp后的各种波之间会有重叠，波峰有钝化现象，碱基与碱基间的距离有时突然加大，这些现象都会影响结果的准确性，只能做为参考。所以说800bp左右是比较有效片段。  测序拿到的峰图可能并不会是理想的单一峰，会出现各种不同类型的峰图，下面就让我们一起来了解一些常见的峰图产生的原因及解决方法。 1、双克隆  现象:前半部分峰图单一，后边片段出现套峰。 原因:PCR产物不纯;挑克隆时，两个不同的菌落混在一起。对策:重新挑单克隆。 2、重叠峰  现象:从一开始就出现两套峰，每个峰下面都有其他颜色的杂峰。原因:PCR主带与杂带混在一起测序，有非特异的PCR产物;模板有两个引物结合位点，同时与引物结合。对策:胶回收，重新测序;重合测序引物。 3、引物二聚体  现象:前面噪音高，后面正常。 原因:引物二聚体未去除干净。 对策:割胶纯化。 4、 引物模板不纯  现象:整个峰图噪音都比较高。引物不纯会造成移码现象，该种现象与模板不纯在峰图都表现为背景峰较杂，引物不纯在峰图上表现的更有规律，一般在每一个主峰前都有一个同一碱基的小峰。 原因:引物(模板)纯度太低，含有较多杂质。 对策:重新合成引物或使用PAGE纯化的测序引物。 另外还有一些常见的酒精峰、染料峰、钉子峰、碱基缺失以及某些特殊结构的峰图，这些我们下篇再说。 |
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