  摘要 我们以前建立了从小鼠组织(肠，胃，胰腺和肝脏)和人的肠和胰腺的有机化合物的长期，三维(3D)培养的系统。我们描述了人体胃干细胞长期三维培养所需的条件。该技术可用于研究上皮对幽门螺杆菌感染的反应。 研究结果  图1 图1：人胃体外培养扩增。 (A)方案和腺体分离图像。 (B)烟酰胺(NIC)增加有机物的形成，而p38抑制剂和转化生长因子β抑制剂不增加。条形表示具有标准偏差的一个培养物的三份副本的平均值。 (C)几种生长因子和抑制剂对人胃培养的影响。转化生长因子βI增加有机化合物的寿命长达30周。 (D)去除任何因素表皮生长因子，noggin，R-海绵蛋白1，Wnt，FGF10，胃泌素和转化生长因子βI限制培养物的生长。去除烟酰胺可以实现长期增长。在B和D中，每个酒吧代表一种新建立的文化。 (E)从人类腺体生长的有机体的例子。插入物显示出萌芽结构。 (F)培养3个月后的核图。比例尺100µm。  图2 图2：人类胃器官分化为四种胃系，并自组织成腺体和凹陷区。 (A)胃标志基因的mRNA表达。以Lgr5为干细胞标志物，MUC5AC为胃凹粘液细胞，PGC为主细胞，SST为肠内分泌细胞，MUC6为腺粘液细胞。胃三叶因子1(TFF1)和TFF2也表达。以管家基因GAPDH作为负荷对照。MUC2，CDX1和CDX2是肠组织的标志物，用于控制组织特异性。 (B)胃粘膜和器官的染色石蜡切片图像。PAS染色也标记坑粘液细胞。 (C)全量有机化合物的共聚焦图像。 (D)增殖细胞用5-乙炔基-2‘-脱氧尿嘧啶核苷(EDU)掺入标记。比例尺100µm。培养条件：ENRWFG_Ti。  图3 图3：有机化合物定向分化为凹坑或腺体细胞系。 (A)Wnt退出时表型变化的例子。培养物在ENRWFGNiTi中生长10天，随后用Wnt(左图)或不用Wnt(右图)保存4天。在Wnt撤除下培养物松散萌发结构，成为大的包囊。 (B)通过来自3个捐赠者的全基因组培养微阵列测量两种生长条件下的差异基因表达。去除Wnt降低了干细胞标记(LGR5，Troy)的表达，并增加了MUC5AC的表达。 (C)已知Wnt反应基因和胃特异基因的定量PCR。将mRNA归一化为GAPDH管家基因。条形表示具有标准偏差的三复体的归一化平均值。 (D)胃和肠标志物的PCR。肠道标志物MUC2、CDX1和CDX2不表达。 (E)染色石蜡切片图像显示MUC5AC和MUC6的差异表达。PGC在两种类型的有机化合物中都有表达。 (F)胃腺和两种器官的方案。在所有的实验中，有机化合物都是按照A.比例尺100µm中描述的那样生长的。  图4 图4：来自人胃粘膜的单个干细胞可以形成胃器官。 (A)分离方案和FACS图。FACS用于在FSC的基础上产生单个细胞。 (B)有机化合物从单个细胞生长的例子。 (C)培养1年的两个单细胞克隆的例子(这里前3代=6周)。 (D)胃标志基因的mRNA表达。肠道标志物MUC2，CDX1和CDX2不表达，并证实组织特异性。 (E)有机化合物染色石蜡切片的图像。去除Wnt后MUC5AC表达增加。培养条件：ENRWFGNiTi(“Wnt”)或4天Wnt退出(“no Wnt”)。比例尺100µm。  图5 图5：正常和肿瘤器官。 (A)从同一患者建立的肿瘤器官(左)和正常器官(右)的亮场图像。 (B)中期扩散A中所示的肿瘤细胞器。7个扩散的计数显示70-160条染色体。 (C)原肿瘤组织和器官的染色石蜡切片图像如A所示。 (D)肿瘤中的有机物对nutlin-3不敏感。有机化合物在指定浓度的nutlin-3下生长1周。用荧光素酶测定法测定细胞活力。条形表示具有标准偏差的三倍体的平均值。比例尺100µm。 结论 人胃细胞在3D基质培养中无限扩增。我们培养的细胞来自健康的胃组织，单一分类的干细胞，或肿瘤组织。有机化合物在组织学、标记表达和整倍体的基础上保持了它们各自组织的许多特征。来自健康组织的有机体表达了胃的4个谱系的标记，并自组织成腺体和凹陷区。它们可以通过添加烟酰胺和撤除WNT来特异性表达胃腺或胃窝的谱系。而胃小凹谱系仅对细菌感染有轻微反应，胃腺系谱系具有强烈的炎症反应。 DOI：10.1053/j.gastro.2014.09.042 参考文献 [1].Karam SM, Leblond CP. Dynamics of epithelial cells in the corpus of the mouse stomach. I. Identification of proliferative cell types and pinpointing of the stem cell. Anat. Rec. 1993; 236:259– 279. [PubMed: 8338232] [2].Bjerknes M, Cheng H. Multipotential stem cells in adult mouse gastric epithelium. Am. J. Physiol.- Gastrointest. Liver Physiol. 2002; 283:G767–G777. [PubMed: 12181193] [3].McDonald SAC, Greaves LC, Gutierrez-Gonzalez L, et al. Mechanisms of Field Cancerization in the Human Stomach: The Expansion and Spread of Mutated Gastric Stem Cells. Gastroenterology. 2008; 134:500–510. [PubMed: 18242216] [4].Barker N, Huch M, Kujala P, et al. Lgr5+ve Stem Cells Drive Self-Renewal in the Stomach and Build Long-Lived Gastric Units In Vitro. Cell Stem Cell. 2010; 6:25–36. [PubMed: 20085740] END |
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