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德国柏林Max Planck感染生物学研究所的Michael Sigal等研究人员在Nature cell biology（IF=17.7）上发表了题目为《R-spondin-3 induces secretory, antimicrobial Lgr5+ cells in the stomach》的文章。该团队的研究人员揭示了一种与已知的促有丝分裂活性机制相反的调控机制—Rspo3诱导胃基底层Lgr5 +细胞分化为分泌型细胞，表达和分泌抗菌因子（如内凝集素-1）进入管腔中。并且通过实验证明了Lgr5 +细胞减少或肌成纤维细胞中Rspo3的敲除，会导致幽门螺杆菌在胃腺以及干细胞区过度定植。相反，在胃基质中过表达Rspo3可从胃腺中清除幽门螺杆菌。 背景介绍 R-spondin（Rspo）与Lgr家族成员结合后，能够激活Wnt信号通路，对于胃肠道干细胞的新陈代谢至关重要。幽门螺杆菌感染胃部后，会刺激肌成纤维细胞分泌Rspo的增加，从而引起胃峡部的Wnt应答Axin2 + Lgr5-干细胞的增殖，以及腺体增生。 作为Lgr5的配体， Rspo不能诱导胃腺基质中Axin2 + Lgr5 +细胞增殖。由于这些细胞直接与最高浓度的Rspo3接触，却不能被诱导增殖，因此，研究人员探讨了它们在感染与未感染幽门螺杆菌时对Rspo的应答机制。他们发现内源性Rspo3是维持Lgr5 +细胞特异性识别特点所必需的，Rspo能够促进它们分化成分泌型细胞。Rspo3能使这一特定的Lgr5 +细胞群体在幽门螺杆菌感染后，分泌抗菌蛋白，通过减少细菌定向扩散至干细胞室来减少细菌的定植。另外，研究人员还发现了其中的抗菌蛋白内凝集素-1（Itln1），发现它能够凝集幽门螺杆菌，削弱其游动性。总之，该研究团队证明了Rspo–Lgr5信号传导通路在胃窦中的作用，Rspo促进Lgr5 +细胞向分泌表型的分化，从而保护腺体免受幽门螺杆菌感染。 结果一 Rspo3 维持Lgr5+ 细胞特异性并且诱导其向分泌表型分化 研究人员首先构建了两种小鼠，分别是Rspo3敲除小鼠（Myh11-CreERT2; Rspo3fl/fl）和Rspo3过表达小鼠（Myh11-CreERT2; Rspo3+/+），并通过实验证明了用他莫昔芬治疗这两种小鼠后，从胃窦组织学、基因表达谱等方面证明了两种小鼠没有显著差异（Fig. 1ab）。通过基因芯片以及qPCR实验，研究人员证明了肌成纤维细胞分泌的Rspo3是维持Lgr5 +细胞特异性识别特点所必需的。通过GFP标记Lgr5+细胞，并通过免疫荧光实验(Fig. 1c)，他们证明了Lgr5+细胞的再生需要Rspo3。为了研究Rspo3到底影响了哪些基因的表达，他们通过基因ontology分析(GO) 发现了一些基因的表达受到调控，发现胃内因子(Gif)和胃蛋白酶原(Pgc)的基因表达下调水平最显著，他们也通过qPCR验证了这些基因表达下调(Fig. 2c,d)。通过免疫点染实验，他们发现Pgc蛋白是由胃基底部的Lgr5+细胞产生的(Fig. 2e)，并且在敲除Rspo3之后，这种蛋白的表达消失了。同时，他们观察到标记胃粘液细胞的GSII也消失了，而表面的Muc5ac+粘液细胞没有受到影响(Fig. 2f)。因此，他们得出结论认为Rspo3有另一种调控作用—诱导胃腺Lgr5+细胞向分泌型细胞分化。 Fig. 1 | 内源性Rspo3 调控胃腺增殖和干细胞信号标记 Fig. 2 | Rspo3调控胃窦基底部的分泌表型 结果二 Lgr5+ 细胞亚群分泌抗菌蛋白以消除幽门螺杆菌感染 研究人员用幽门螺杆菌感染Lgr5-EGFP小鼠两个月后，进行RNA测序以及GO分析显示受调控的基因大多涉及免疫应答和免疫防御，比如Reg3g和载脂蛋白2、Itln1 、Olfm4. 他们也通过smFISH实验验证了上述结果(Fig. 3b)。 为了表征Lgr5 +细胞的潜在异质性以及对感染免疫应答，他们对Lgr5-EGFP报告基因小鼠（感染与未感染幽门螺杆菌）中分选出的eGFP +细胞进行RNA测序，验证了5个基因表达相似的细胞群，发现不同细胞群代表了不同胃腺细胞谱的前体细胞(Fig. 3)。从细胞簇分析中，他们发现表达分泌蛋白的基因Pgc和Gif受Rspo3调节，也发现了前人鉴定的Lgr5 +细胞标记基因Cd44，Sox9和Lgr5（Fig. 3f），受Wnt–Rspo3信号调控。接下来，他们将研究目标聚焦到与增殖相关的基因，如Ki67，Pcna和细胞周期蛋白D1，在亚群1中显示表达水平最低（Fig. 3f），表明亚群1中的分泌型细胞受Rspo3影响最大。 为了验证高浓度的Rspo3是否可以在体外促进分化，研究人员将胃类器官暴露于不同浓度的Rspo3。他们发现在分泌型Lgr5 +细胞中Lgr5、Gif和Pgc的表达水平是浓度依赖性的（Fig. 4c）。有趣的是，在中等Rspo浓度下细胞增殖水平最高，而在较高的Rspo浓度中细胞增殖水平下降（Fig. 4a,b）。与胃腺标记细胞水平相反，当类器官暴露于Rspo时，表面黏液细胞标志物Muc5ac的表达降低(Fig. 4c)。这些现象验证了暴露于胃腺的高Rspo3浓度中，会诱导细胞分化为深层粘膜细胞，而胃峡部的低浓度Rspo3反而会刺激细胞增殖。接下来，研究人员从细胞水平上研究了幽门螺杆菌感染如何影响Lgr5 +细胞。在幽门螺杆菌感染后，他们再次验证了五个细胞亚群(Fig. 3d)，发现在细胞亚群1中检测到了一定比例的高表达细胞，发现这些细胞对感染和免疫反应相关，同时他们也发现了编码分泌型抗菌蛋白的基因也有所上调，例如Reg3g和Itln1。然后他们通过小鼠实验，证明了Lgr5 +细胞有助于抗菌防御。 Fig. 3 | Lgr5 +细胞的一个亚群表达抗菌基因来抵消感染 Fig. 4 |用不同浓度的Rspo生长的类器官的基因表达和形态 结果三 Rspo3对胃腺上皮抵抗幽门螺杆菌的防御机制至关重要 该团队发现了Rspo3调节Lgr5 +细胞分泌抗菌蛋白之后，开始探讨Rspo3敲除后如何在体内影响幽门螺杆菌感染。他们使用了两种小鼠：Rspo3敲除小鼠（Myh11-CreERT2; Rspo3fl/fl）和Rspo3过表达小鼠（Myh11-CreERT2; Rspo3+/+），先用他莫昔芬治疗后再在不同时间段感染幽门螺杆菌，定植量分析显示两者都具有较高的细菌定植(Fig. 5a)，感染后两三个月，敲除小鼠的菌定植量明显高于 野生型小鼠（WT），在感染后几周两者的定植量出现显著差异。他们通过共聚焦显微镜发现缺乏Rspo3的小鼠的幽门螺杆菌定植量显著高于野生型小鼠，这种差异在感染两个月之后更明显。 为了进一步研究Rspo在幽门螺杆菌感染中的作用，研究人员通过对小鼠全身性注射Rspo以及过表达Rspo，然后检测胃腺以及过渡区的菌定植(Fig. 5g,h)，他们发现注射单剂量的Rspo之后，胃腺中可见的幽门螺杆菌几乎全被清除，定植量也呈现出显著下降的趋势(Fig. 5j)。然而，Rspo处理的小鼠胃窦中的Itln1基因的表达水平显著上调，而Rspo缺乏的小鼠中该基因表达水平更低。总之，他们进一步证实了在上皮细胞中Itln1的表达也依赖于Rspo，因此，他们得出结论认为Rspo3对于诱导Lgr5 +细胞分泌抗菌蛋白以抵抗幽门螺杆菌在胃腺的定植至关重要。 Fig. 5 | Rspo3抵消幽门螺杆菌感染 结果四 Lgr5+分泌的Itln1能够粘附H. pylori. 该团队的研究人员决定进一步研究Itln1在感染进程中的作用。Itln1是一种分泌的凝集素，在肠道Paneth细胞中高表达，最近有报道称Itln1能够特异性结合细菌而不是宿主，我们对未感染和感染幽门螺杆菌的Lgr5-EGFP报告基因小鼠的Itln1进行了免疫染色，未感染小鼠的胃腺仅显示出微弱的信号，感染导致胞内带有Itln1+颗粒的Lgr5+细胞数量上升(Fig. 7a)。此外，在管腔中也检测到蛋白质信号，免疫标记发现幽门螺杆菌和Itln1显示共定位，表明Itln1在小鼠体内可以直接结合幽门螺杆菌(Fig. 7b)。 为了探索这种相互作用的重要性，他们进行了体外结合试验，发现基因合成的Itln1确实以Ca2+依赖的方式结合幽门螺杆菌(Fig. 7c)。结晶紫染色显示该蛋白有效凝集幽门螺杆菌(Fig. 7e,f)，并且发现该凝集依赖于Ca2+。因此，他们得出结论认为幽门螺杆菌可被Itln1凝集，而Itln1是由Lgr5 +细胞分泌到腺腔中发挥抗菌效果的。 Fig. 6 | Rspo3在成肌纤维细胞中的过度表达会扩大腺基黏液细胞并限制腺定植 Fig. 7 |感染后，Lgr5 +细胞将Itln1分泌到腺管腔中以结合并凝集幽门螺杆菌 讨论 幽门螺杆菌与上皮细胞的直接相互作用能够诱导DNA损伤，并激活致癌信号途径。该研究团队证明了Rspo–Lgr5信号传导通路在胃窦中的作用，Rspo促进Lgr5 +细胞向分泌表型的分化，从而保护腺体免受幽门螺杆菌感染。因此，通过Rspo信号传导途径来限制胃腺幽门螺杆菌定植，对于降低细菌诱导的干细胞损伤和癌变风险具有重要作用。幽门螺杆菌感染能引起宿主上皮细胞基因损伤，对干细胞室的稳定性具有极大的威胁，而该研究团队的发现对于干细胞的保护以及抗菌防御机制提供了重要证据。 1. Helicobacter pylori Activates and Expands Lgr5+ Stem Cells Through Direct Colonization of the Gastric Glands[J]. Gastroenterology, 2015, 148(7):1392-1404.e21. 2. Sigal, M. et al. Stromal R-spondin orchestrates gastric epithelial stem cells and gland homeostasis. Nature 548, 451–455 (2017). 3. Manuel R. Amieva, Emad M. El–Omar. Host-Bacterial Interactions in Helicobacter pylori Infection [J].2015. 134(1):306-323. 原文链接 https:///10.1038/s41556-019-0339-9. ◆《新英格兰医学杂志》“Clinical Practice”版块发表强调幽门螺杆菌的病例摘要 ◆重磅！Lancet子刊发文证实现行幽门螺杆菌根除方案的长期安全性 ◆随访22年，北大肿瘤医学院学者发现幽门螺杆菌根除治疗，长期补充微生物或大蒜，可降低胃癌风险 撰稿：童倩 校对：BHK 编辑：白越凡 |
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