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蛋白质是生命体发挥功能的重要元件，通过生物反应实现高效的功能。越来越多的研究表明，特定功能的蛋白可以在药物研发、生物感应、环境工程等方向发挥不可替代的关键作用。然而，天然存在的蛋白往往在应用上功能单一，缺乏可控性，使用效率低，亟待发现可通过外界信号控制的功能蛋白，以适应在所需环境下进行精细调控的功能“开关”。随着对蛋白变构机制理解的不断加深，一些研究机构开始将变构融入蛋白的改造，实现对蛋白功能的条件性调控，包括把整个变构调控结构域插入到靶标蛋白，共价结合光控开关来产生光响应蛋白，靶向替换特定的氨基酸残基等，这些探索已经给医学和生物工程领域带来了大量技术突破。今天我们和大家分享一下这方面的工作。 
Parker实验室专注于研究不同细菌中的氨基酸生物合成的变构机制[1]。他们的变构蛋白设计的方法是将桶状酶的ACT或CM结构域拼接到另一个蛋白的催化结构域上，ACT结构域包括β-α-β-β-α-β折叠。在低聚状态下，配体结合在ACT结构域引起构象改变调控催化结构域的功能。CM结构域是分支酸变位酶的调节结构域使分支算生成丙酸，丙酸结合在CM结构域上会引起构象变化。他们将海栖热袍菌的DAH7PS的ACT结构域拼接到火球菌的DAH7PS（它没有调节结构域）上。新的嵌合蛋白是有活性的而且能被酪氨酸调控，调控方式类似海栖热袍菌的DAH7PS。之后，他们还将海栖热袍菌和地芽孢杆菌的DAH7PS的调节结构域互换，新的融合蛋白同样能产生变构调节机制。通过简单的结构插入和替换既可以产生变构效应说明变构机制对于这些蛋白或这种折叠方式的蛋白是一种固有的属性。
将调节结构域插入到催化结构域中间也能产生新的嵌合变构蛋白。例如，将MBP结构域的317和318中间插入BLA结构域可以产生麦芽糖依赖的β-内酰胺酶麦芽糖结合蛋白，在BLA的N端和MBP结构域的319残基中间插入Asp-Lys-Thr序列。这个融合体C4没有变构调节机制但是有催化活性。但是，通过改变linker，他们设计出了变构变异体。例如，他们把多个甘氨酸加到linker上可以引起温度依赖性的变构调控机制。在另一个变异体中，Asp-Lys-Thr序列被Glu-Ala-Gln-Ala取代，这个蛋白可以在高PH或高温度下有很大的构象异质性。这些研究表明设计的蛋白可以响应生理环境的变化，提供了在另一个层面调控蛋白的例子。 同样地，在BLA结构域中间插入钙调蛋白，将BLA分成BLA 24-196和BLA 196-286。这个嵌合体在缺乏Ca2+时有β-内酰胺酶活性因为钙调蛋白中间螺旋部分在这样条件下是无序的，使得BLA结构域的两部分联系在一起。在结合Ca2+时，螺旋变得更加刚性，使得BLA两部分分开，因而蛋白活性丧失了。在这个例子中，从热动力学的角度来说，高熵状态更有活性因为BLA的疏水核心区跟易于联系在一起而使溶剂分子远离非极性氨基酸。 还有一个非常特殊的例子，就是Ca2+电化学传感器。一个钙离子结构域插入到氧化还原酶PQQ-葡糖脱氢酶，来产生一个可以定量生物流体中Ca2+浓度的感应器。在PQQ-葡糖脱氢酶的第三个β折叠的套索A和B之间的无规则卷曲被选为钙调结构域的插入位点因为套索A是催化结构域中参与吸收葡萄糖O1原子上电子的部分。在结合Ca2+后的构象变化会激活PQQ-葡糖脱氢酶催化的氧化还原反应，产生电脉冲。结果表明该嵌合体的确可以检测到唾液中稀少的Ca2+。 变构和远程通信可能对于所有蛋白都是一种固有属性。和整个结构域的插入不同的是，一些微小的变化可能会导致新的变构机制。蛋白骨架的共价修饰是另一种改变或创造变构效应的方法。共价修饰可以通过增加一个连接器限制构象，或者扰动氨基酸相互作用网络来将一个化学分子接合到不稳定的暴露在表面的氨基酸。一个典型的例子就是利用螺旋霉素光电开关作为连接器设计了一个光敏感的人类血清蛋白。这个连接器通过加成反应接到子结构域IA表面的半胱氨酸，使得能够调控远在130A的子结构域IB释放配体。分子动力学模拟表明子结构域并不是直接相互作用，而是通过远程网络作用改变小分子的亲和力。
一个非常有用的共价修饰是偶氮苯光电开关，它可以可逆地在顺式和反式构象间转换。这个开关可以在多肽合成时引入到多肽，可以在体内或体外接到蛋白的非天然氨基酸上，可以交联到蛋白表面的半胱氨酸上，或者加到蛋白的配体分子上。通常来说，共价修饰后的偶氮苯衍生物在顺式和反式构象间的转变能够改变蛋白活化和非活化构象的相对自由能。例如，将偶氮苯衍生物交联到限制性内切酶PvuII上，使得光可逆地变构抑制蛋白。其中两个半胱氨酸连接到双功能偶氮苯衍生物4,4-亚胺基偶氮苯上。从顺式到反式的构象变化破坏了PvuII的二级结构，改变了活性位点的结构，使得酶活降低16倍。另一个例子中，在细胞黏附蛋白钙黏蛋白的两个半胱氨酸交联上双功能偶氮苯衍生物BSBCA。在紫外线照射下，Ca2+的亲和力降低了18倍。Ca2+的结合和蛋白的二聚化相关从而导致光照调控蛋白功能。表面关键残基可以被共价修饰来调控蛋白功能。例如，DegS（一种细菌丝氨酸蛋白酶）可以被一类喹唑啉-4（3H）异羟肟脂小分子通过共价修饰在赖氨酸来变构激活。通过改变被修饰的赖氨酸，能够知道哪种修饰引起变构激活。对于蛋白激活重要的赖氨酸在变构氨基酸相互作用网络中的一部分[2]。将点突变引入到蛋白中在分子生物学和生物化学中很常见。如果预先知道蛋白的序列和结构，对氨基酸序列修饰可用以产生PH可调控的蛋白，或者识别和修饰和蛋白功能相关的互作网络中的氨基酸。和全结构域插入或共价修饰不同的是，这些工作只是对蛋白做微小的改变。NP4是猎蝽分泌的一种蛋白，它可以选择性地将一氧化氮释放到猎物的组织。在高PH的组织中被质子化时，关键残基D30的氢键断裂，引起构象变化导致结合的一氧化氮释放。Di Russo等人利用PH复制交换分子动力学（PH-REMD）来研究NP4的PH依赖性的构象变化的自由能景观[3]。在扰动开放构象但不影响D30的pKa的情况下构建突变体，他们发现pKa的观测值依赖于两种构象的平衡常数，以及模型预测的pKa。除了构象的平衡常数，深埋可电离残基的pKa和局部动力学特征还可以通过改变表面电荷的分布情况来改进。
目前有非常多的例子通过将深埋内部的残基替换为可电离残基来设计感受PH变化的蛋白。例如，Zimenkov等设计了可以随PH值改变而自组装到纤维的多肽[4]。自组装的发生是由于螺旋的组氨酸发生质子化而导致多肽的螺旋转变为线圈结构。还有一些例子是设计PH-敏感的蛋白。纤连蛋白（Fn3）结构域是一种可以用来设计的蛋白骨架，新设计的蛋白可以结合和心血管疾病以及肿瘤相关的蛋白。在Fn3结构域的疏水核心区域加入组氨酸，Fn3可以在低PH情况下以较低的亲和力结合EGFR。在过去几十年，有很多突变实验识别和扰动了氨基酸互作网络。在很多例子中，改变远离活性位点的网络残基在蛋白功能和变构效应中有广泛的应用，同时也对变构药物发现和变构位点识别有很大启示。对于细胞信号转导来说长期存在的一个问题是调控底物和蛋白相互作用的特异性。比如，多个PDZ结构域都存在底物特异性低的问题，各自又都扮演不同的生理功能。有研究表明，利用双突变循环分析PDZ结构域存在独特的变构网络。双突变循环分析能够确认两个位点是否是在能量上是变构偶联的。利用这种方法已经确定了31种蛋白突变体和他们结合分子的结合动力学参数。引入突变还可以提供在变构传导上具有重要作用的氨基酸互作网络的实验证据。比如，利用去限制技术和单位点多重突变技术（RASSMM）[5]，在亲环蛋白A上识别了两个动态残基区域。在这两个区域，两个关键的热点残基被识别出来。当这些残基发生扰动时，尽管这两个残基距离活性位点超过15A，活性位点的动力学还是发生了负性调控。
之前所有的例子都是去创造新的变构蛋白，但是有时我们会需要在维持蛋白其他功能的情况下使蛋白不响应变构调控。比如，代谢酶通常是被变构调控的，但这种调控可能会影响某个特定分子的合成。一个典型的例子是对色氨酸合成酶（TS）的设计，它负责合成新的吲哚类似物。TS包括两个亚基，α亚基生成吲哚，然后通过疏水通道将产物送到β亚基完成色氨酸的合成。只有Β亚基的催化活性对于吲哚类似物的生成式必须的，但在缺少α亚基的情况下β亚基的活性大大降低。Arnold实验室尝试利用定向进化来生成新的β亚基能够在缺少α亚基的情况下可以被变构激活。最后新的β亚基具有强于天然蛋白的催化活性，同时能结合更多样化的底物分子。综上所述，核酸类大分子作为调控元件进行生物传感器等大分子设计已经发展多年，但其一直受效率及稳定性等多种因素制约，且其缺乏像蛋白一样的功能多样性。变构作为蛋白内的固有属性，随着其机制理解的不断深入为利用变构进行可控性蛋白设计提供了契机，上面提到的例子给我们提供了很好的指导作用。如能开发更多具有变构调控特征的结构域，通过与来自原核到真核生物中的各种功能蛋白进行组装，可以大大提升这些功能蛋白在生物医学工程使用的灵活性，提高其使用效率，推动生物医药行业发生革命性的变化。
参考文献 1. Cross PJ, Allison TM, Dobson RC, JamesonGB, Parker EJ. Engineering allosteric control toanunregulated enzyme by transfer of a regulatory domain. pp 1091–6490.2. Bongard J, Lorenz M, Vetter IR, Stege P,Porfetye AT, Schmitz AL, Kaschani F, Wolf A,Koch U, Nussbaumer P, Klebl B,Kaiser MA, Ehrmann MA. Identification of NoncatalyticLysineResidues from Allosteric Circuits via Covalent Probes. pp 1554–8937.3. Di RussoNV, Marti MA, Roitberg AE (2014) Underlying thermodynamics ofpH-dependentallostery. J Phys ChemB 118(45):12818–12826.4. ZimenkovY, Dublin SN, Ni R, Tu RS, Breedveld V, Apkarian RP, Conticello VP(2006)Rational design of a reversible pH-responsive switch for peptideself-assembly. J Am ChemSoc 128(21):6770–6771.5. Holliday MJ, Camilloni C, Armstrong GS,Vendruscolo M, Eisenmesser EZ (2017) Networksof dynamic Allostery regulateenzyme function. Structure (London, England: 1993)25(2):276–286.6. Scott D. GormanRebecca N. D’AmicoDennis S. WinstonDavid D. Boehr. Engineering Allostery into Proteins. Protein Allostery in Drug Discovery 2019, pp 359-384.
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