【原】【别构】配体-蛋白结合力控制别构调控方式和别构路径

别构调控描述了蛋白质活性位点的功能变化是由远处位点的扰动（配体结合、突变等）引起的一种现象。最初对别构的描述是基于构象变化或诱导契合模型，这一概念后来扩展到了系综别构，用来理解没有构象变化发生的情况。别构调节在许多生物学过程中起着关键作用，与许多人类疾病如神经退行性疾病和癌症密切相关。许多G蛋白偶联受体、转录因子和激酶是典型的别构蛋白。自然界利用别构作用可以很容易地上调或下调靶蛋白活性，这使得设计别构药物来激活或抑制所需的蛋白质功能，成为一种很有前途的方法。别构药物具有更高的特异性和较少的副作用，因此人们在别构激活剂和抑制剂的研究上投入了大量的精力。

然而，决定别构调控类型的因素仍然十分模糊，目前还无法在实验研究之前预测别构化合物是否会激活或抑制靶标功能。近期北京大学来鲁华课题组和刘志荣课题组合作于Journal of Physical Chemistry Letters杂志发表题为“Allosteric Type and Pathways Are Governed by the Forces of Protein−Ligand Binding”的文章，通过结合位点处的受力分析，开发了AlloType程序，首次实现先验性预测别构调控方式。

——基本原理——

图1 AlloType的工作流程（P：蛋白，A：别构配体，S：底物）

别构可以通过热力学循环的角度来分析，配体结合可以改变底物结合常数K_M或者催化速率常数k_cat。作者这里集中于结合步，因此别构调控方式可以定量表征为别构配体结合前后，底物结合自由能之差（图1A）：

小于0代表别构激活，大于0代表别构抑制。而要得到这个量，作者需要计算四种状态的自由能(ΔΔG=GP_AS+G_P-G_PA-G_PS)，不幸的是，通常这四种状态的结构信息无法兼得，因此需要建立一个模拟缺失结构的模型。从热力学角度考虑，蛋白质结构变化主要由于配体施加的外力导致，这一过程可以通过线性响应理论（LRT）很好地描述，这个方法广泛用于预测配体结合后的蛋白构象变化：

左边代表配体结合后各个残基的位置变化，表示蛋白自由态的协方差矩阵，而最后的f即为配体施加在残基上的力。利用这个关系，作者一方面可以推导出结合口袋的受力分布，同时也可以模拟缺失的结构信息。

作者进一步用各向异性网络模型（ANM）来描述蛋白结构的响应，这个模型将蛋白粗粒化成位于Ca上的节点，节点之间若处于截断值以内，则用相同弹性系数的弹簧连接。假设蛋白自由态为能量零点，则任意状态的能量可以近似表示为：

其中R_P和R分别代表口袋残基和整个蛋白的残基，f_P即为口袋的受力。因此别构调控方式便可以推导出，AlloType完整的流程见图1B。首先由自由态获得协方差矩阵C，然后叠合配体结合前后的结构得到ΔR，通过正规方程反推出口袋的受力分布f:

由于作者在这里规定只有口袋残基可以被配体施加力，只有对应于口袋残基的协方差矩阵列在这里被利用，因此存在一个最合适的结合构象，完全由拟合出的受力导致的。于是四个状态的自由能均可得到，ΔΔG因此也可以推导出。

——数据集验证——

为了验证其效果，作者收集了16个别构蛋白体系（Table 1），这些体系均有蛋白自由态和结合态的实验结构信息和别构类型。其中13个均能得到正确的类型，准确率在80%以上。所有8个单体均被正确预测，而8个多聚体中，有5个被正确预测。对于另三个失败的例子，可能原因是AlloType基于二态模型，并没有考虑系综变化，以及涉及多级寡聚的情况，正如CAP以及GLS体系。

——别构路径——

图2 别构路径预测

别构信号如何从远端生成进而传递到活性位点吸引了很多关注，能量流被认为是别构信号传播的方式。因此作者计算了每个残基的ΔΔG，从中挑出变化较大的残基，观察是否存在一条连接两个位点的路径。为了跟之前的工作对比，作者挑选了PTP1B和DHPS，对于前者，很明显看到别构信号从P188,L192,E276,G277，通过中间的α-helix（T224, I261, Q266, F269, and I275）,传递到活性位点，以及WPD loop（W179-D181）。这个狭窄的路径之前也通过图分析和进化分析报道过。而对于DHPS，别构抑制剂结合导致界面更刚性，活性位点的运动随之而改变，也与之前的研究一致。

——别构药物预测——

图3 GPX4别构激活剂预测

在实际的别构药物发现过程中，往往仅有自由态蛋白结构已知，为了测试AlloType是否真的可以预先得到别构分子的调控方式，作者选取了GPX4，一种与铁死亡有关的蛋白，课题组之前报道了8个别构激活剂。由于只有apo态结构已知，作者通过对接和MD模拟得到结合态的构象系综，后续通过聚类得到代表性构象，作为结合态构象，AlloType对这8个分子均给出了负的ΔΔG，与实验一致。3条潜在别构路径连接D21,D23和催化残基C46,Q81,W136，分别经由中间的coil(K105-N109),底部的helix-coil（K48, E50, Y53, E82,G84 and I89），和连续的β-sheet (K151-G154, L142-D144, F35-V36, and R69-I70)。

——小结——

本文，作者通过ANM和LRT获得结合口袋的受力分布，进而确认其别构调控类型。AlloType对测试集中81%的别构蛋白均能正确确认其别构调控模式，并能确认潜在的别构通路。即使仅用apo态的结构信息，仍能得到很好的效果。AlloType目前已经发布在https://github.com/qj-Huang/AlloType，有需要的人可以下载，另外一份详细的教程也发布在网站上，帮助读者重现文中的数据并更好使用程序。

参考文献：

Huang, Qiaojing, et al. “Allosteric Type and Pathways Are Governed by the Forces of Protein−Ligand Binding” J. Phys. Chem. Lett. 2021. 12:5404−5412. 

DOI: 10.1021/acs.jpclett.1c01253