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超60篇文献 | 细聊肝细胞癌免疫治疗生物标志物

 jfjzyya038 2019-12-08

来源:探肝

多种免疫反应机制能够靶向肿瘤细胞从而激发机体对肿瘤的免疫应答。在过去的几十年中,包括细胞免疫、细胞因子、肿瘤疫苗和免疫检查点抑制的癌症免疫疗法得到了广泛的研究,并取得了重大进展【1】。通过靶向包括细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)和程序性细胞死亡1配体1(PD-L1)的免疫检查点受体或配体,免疫检查点抑制疗法打破了免疫耐受并延缓了肿瘤进展【2】。目前为止CTLA-4、PD-1/PD-L1抗体已被FDA批准用于治疗晚期或转移性黑色素瘤、非小细胞肺癌、广泛期小细胞肺癌、肾细胞癌、经典霍奇金淋巴瘤、尿路上皮癌、头颈部鳞状细胞癌、Merkel细胞癌、三阴性乳腺癌、子宫内膜癌、宫颈癌、结直肠癌、肝细胞癌、胃腺癌或胃食管交界腺癌、食管鳞状细胞癌、纵隔大B细胞淋巴瘤,以及MSI-H/dMMR实体瘤(可见附表1 截止到2019年11月 FDA和NMPA批准的ICIs)。基于CheckMate 040【3】和KEYNOTE-224【4】的临床试验结果,FDA批准Nivolumab和Pembrolizumab用于一线经索拉非尼治疗后未观察到或几乎没有观察到阳性临床反应的HCC患者的二线治疗。在2019年ESMO大会上,罗氏公司在其官网公布了III期研究IMbrave150的数据,对于不可手术的HCC患者,比对一线索拉非尼的标准疗法,PD-L1抑制剂Atezolizumab联合抗血管生成靶向药Bevacizumab可改善OS和PFS,并在随后的2019 ESMO-ASIA会议上披露了详细的数据:与索拉非尼相比,Atezolizumab+Bevacizumab可使死亡(OS)风险降低42%(风险比[HR]=0.58;95%CI:0.42-0.79;p=0.0006),使疾病恶化或死亡(PFS)风险降低41%(HR=0.59;95%CI:0.47-0.76;p<0.0001);联合疗法与索拉非尼单药疗法的已知安全性一致【5,6】。

免疫检查点抑制或将进入肝癌的一线治疗。但因HCC的高度异质性,其免疫检查点抑制治疗仍面临着巨大的挑战。尽管临床免疫治疗取得了初步的可喜结果,如何使更多的患者从免疫治疗中获益仍是一个有待继续解决的难题。虽然免疫检查点抑制治疗的反应率在不同的肿瘤类型中不同,但在所有癌症类型中其总体客观反应率仅为29%【7】。同时,在用抗PD-L1 / PD-1药物治疗的癌症患者中,9~29%观察到超进展性疾病(HPD),并且可能与较短的无进展生存期(PFS)相关【8,9】。免疫不良反应和耐药性是限制其临床应用的主要挑战。探索与免疫检查点抑制治疗相关的生物标志物具有重要意义。因此,通过标志物对正在进行免疫治疗的个体进行动态监测,对于正确评估免疫治疗的疗效和预后至关重要。在本文中,回顾了近期HCC免疫治疗研究中生物标志物相关探索。

肿瘤突变负荷

一般而言,肿瘤突变负荷(TMB)是去除胚系突变后肿瘤基因组中体细胞中非同义突变的数量,表示为肿瘤组织中评估的基因编码区每兆碱基中的SNV、InDel的总数。研究显示,TMB可以解释不同癌症类型中55%的ORR(客观反应率)差异,相关性系数为0.74(P <0.001)。与PD-L1蛋白表达相比,尽管多种癌症之间TMB存在差异,但高TMB是一种新兴的、对免疫检查点抑制剂的敏感的生物标志物。WES是评估TMB的金标准。2019年11月12日,FDA批准了NantHealth公司的Omics Core获得510(k)许可,使其成为FDA批准的首个基于WES的TMB检测方法【10】。
与WES相比,针对315个基因共1.1 Mb编码基因区域的Foundation Medicine公司的CGP(全面基因组分析)Panel可以准确评估TMB【11】。在多种肿瘤类型中,使用CGP Panel计算的TMB显示,高TMB与抗PD-1 / PD-L1免疫治疗较好的结果相关(包括缓解率、PFS)【12】。Foundation Medicine的Foundation One CDx已被美国FDA批准用于个体化肿瘤,成为第一个FDA批准的基于NGS的综合伴随诊断产品。随后的临床研究显示TMB在肿瘤免疫治疗中的作用越来越明显,基于肿瘤组织的难获取性及异质性,研究者也将目标转移到bTMB(基于血液样本的TMB)的研究上,如在2017 年ESMO会议上公布的POPLAR 和 OAK 研究【13】。2019年ESMO大会上的一篇研究总结了使用TMB作为免疫治疗生物标志物的临床实践情况(表1)【14】.

表1 使用TMB作为免疫治疗生物标志物的临床实践情况

在2019年的ASCO大会上,摘要1573的研究显示:在肝癌患者中,LRP1B突变与高TMB显著相关:TCGA cohort (P=0.0003),Clinical cohort(P=0.0005);TP53突变也与较高的TMB相关:TCGA cohort (P=0.0005),Clinical cohort (P=0.0010)【15】。但在2019年WCLC大会上公布的KEYNOTE 189和 KEYNOTE 021数据表明,在非小细胞肺癌患者中,tTMB(基于肿瘤组织样本的TMB)不能预测Pembrolizumab联合化疗治疗的生存获益优势人群【16,17】。2019年11月公布的ABACUS研究也显示,在尿路上皮癌中,TMB不能预测atezolizumab的治疗疗效【18】。这些临床研究的结果均使得TMB遭到质疑。这也从侧面反映,我们对TMB缺乏检测标准、对肿瘤认知的存在局限,针对受多因子影响的肿瘤,单一运用一个生物标志物预测免疫治疗效果是不够充分的。一项研究对755例晚期HCC患者的TMB进行了评估,结果显示:(1)HCC患者的中位TMB = 4 Muts/ Mb,只有0.8%的患者为高TMB;(2)对17例患者进行了生物标志物与ICI应答之间关系探索,一名患者(TMB = 15 Muts/ Mb,MSI低)对Nivolumab的完全缓解时间持续> 2年,但应答者、进展者和疾病稳定者在基因组之间或TMB上没有显著差异【19】。另一项研究显示,在HCC患者中,预测的高TMB患者的预后要比低TMB患者的预后差【20】。总体而言,目前探索TMB与HCC免疫治疗之间的关系的相关研究还很有限的。

肿瘤抗原(肿瘤相关抗原+肿瘤新抗原)

肿瘤抗原是通过诸如基因突变、蛋白质截短、蛋白质错误折叠或异常的翻译后修饰而改变的分子【21】。正常情况下,适应性免疫系统依赖于肿瘤抗原来监测和鉴定肿瘤是否为外来物或非自身物质。肿瘤抗原可分为两大类:肿瘤相关抗原(TAAs)和肿瘤特异性抗原(TSAs)。
与正常细胞相比,癌症中TAA表达水平的差异使得TAA被作为癌症治疗中的诊断和预后生物标志物或靶标而进行研究【22】。其中甲胎蛋白(AFP)就是一种已经被鉴定的TAA,并通常在HCC中高水平表达。转录组和其他数据显示AFP通过减少脂肪酸合成和线粒体代谢而对树突状细胞(DCs)代谢产生负面影响【23】。(注:DC是目前所知的功能最强的抗原提呈细胞)公共RNA测序数据库中的AFP表达谱显示,约30%的HCC AFP转录表达水平显著高于任何非恶性对照样本中发现的转录表达水平【24】。这种癌症特异性过表达表明AFP可能是HCC免疫疗法的有希望的靶标。
TSA表现为组织特异性表达,并且通常在肿瘤中过表达,可以理解为TSA存在于肿瘤细胞上但不存在于正常细胞上。由基因编码序列突变或重排产生的抗原和病毒抗原是高度肿瘤特异性抗原,其具有引发免疫应答的潜力【25】。大多数HCC病例(约80%)与慢性乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)感染有关【26】。HBV促进HCC的发展可能是通过将HBV DNA整合到宿主基因组中,在85~90%的HBV-HCC(HBV相关性HCC)患者中观察到这一现象【27】。HBV DNA整合到宿主基因组发生在肿瘤克隆扩增的早期阶段,并引起基因组不稳定和多种癌症相关基因的突变。与非酒精性脂肪性肝炎(NASH)相关的HCC以及HCV相关的HCC相比,在HBV-HCC患者中PD-1高表达的CD8 + T细胞出现的频率最高,表明基于HCC病因学的免疫治疗的发展可能会产生更有效的治疗结果【28】。NGS的出现促进了HCC患者中整合的HBV表征分析,从而可以从癌症基因组测序数据中获得肿瘤病毒图谱。单细胞全基因组测序表明HBV整合是肿瘤早期的一个驱动事件,并且在肿瘤进展期间保持稳定【29】。HCC细胞中整合的HBV-DNA短片段转录产物,可编码被T细胞识别并激活T细胞的表位,这些表位可用于工程化T细胞从而进行个性化免疫治疗【30】。
与整合的HBV-DNA一样,能到导致氨基酸改变、阅读框的相位改变或将编码序列扩展到正常终止密码子之外的基因突变可能会产生新的抗原肽,也就是新抗原。目前对新抗原的研究主要集中在潜在的大量肿瘤特异性新抗原肽上,这些肿瘤新肽由癌症基因组中的体细胞突变引起。通常认为,携带更多突变的肿瘤可能产生更多可被肿瘤浸润性T细胞识别的新表位。在接受索拉非尼治疗的晚期HCC患者中,T细胞可以识别新抗原,通过对正常和肿瘤组织进行全外显子组测序,并使用肽-MHC结合力的预测算法对新肽进行鉴定,鉴定出的新肽可能在索拉非尼诱导的肿瘤微环境中进行免疫调节后导致癌症消除【31】。在其他癌症中,也观察到新抗原与临床获益相关。针对黑色素瘤患者,预测的新抗原具有激活的T细胞的作用,且具有新抗原的患者能够从抗CTLA-4治疗中获得长期临床获益【32】。接受pembrolizumab治疗的非小细胞肺癌(NSCLC)患者,其高肿瘤突变负荷与高肿瘤新抗原负荷有关,并可改善PFS至14.5个月【33】。然而,生存分析显示,体细胞错义突变负荷高于平均水平并且可预测新抗原负荷的多发性骨髓瘤患者,其无进展生存期(PFS)明显缩短,这也提示高突变负荷和新抗原负荷是临床相关的危险因素,会对多发性骨髓瘤患者的生存产生负面影响【34】。通过对TCGA数据库中HCC患者的RNA-Seq数据进行回顾分析发现:(1)与其他肿瘤的预期和报道相反,TMB并未显示出对HCC患者生存的影响,而较低的TMB与长期生存相关;(2)无论预测的新抗原质量如何,预测的新抗原的数量均未显示与存活率直接相关的趋势,具有较低新抗原数量的患者其总生存期比具有较高抗原数量的患者总生存期更长【35】。有必要探讨肿瘤新抗原或肿瘤新抗原负荷对HCC免疫治疗反应的影响。

dMMR和MSI

无论癌症的起源组织如何,美国FDA已批准pembrolizumab用于治疗MSI-H或dMMR晚期实体瘤【36】,因此也包括HCC。在一线索拉非尼后用pembrolizumab进行二线治疗的单臂研究中(KEYNOTE-224)【4】,104例HCC患者的ORR为16.3%,包括1例完全缓解和16例部分缓解,中位OS为12.9个月。然而,HCC中MSI-H或dMMR的发生率较低(~3%)【37】。绝大多数MSI-High样本具有高TMB(83%)表明MSI阳性肿瘤是高TMB肿瘤的特定类型【11】。在目前的临床实践中,微卫星不稳定性检测通过MSI-PCR和MMR-IHC等实验方法进行。然而,对于微卫星标记,由于存在组织或肿瘤特异性,不可能准确地检测多个肿瘤中的MSI状态;对于MMR蛋白,由于MMR可能不是导致MSI的唯一原因,因此使用MMR蛋白表达的IHC(免疫组化)检测间接确定MSI状态存在局限性。Memorial Sloan Kettering癌症中心(MSKCC)的一项研究使用MSIsensor分析来自12288名实体瘤患者的靶向测序数据以确定MSI状态并通过MSI-PCR / MMR-IHC方法进行验证,结果表明通过MSIsensor分析能够从大Panel的NGS数据推断MSI状态【38】。使用 Guardant360 (一款包含74个基因的液体活检 panel,包含90个MSI位点)对40种不同癌症类型的1145 份cfDNA样本MSI状态进行临床验证,这些患者的样本先前已通过标准组织样本活检(IHC/PCR/NGS方法)检测了MSI状态,结果显示:血浆cfDNA检测确定了87%(71/82)先前肿瘤组织报告为MSI-H的患者,99.5%(863/867)先前组织报告为MSS的患者,总体一致性(准确率)达到了 98.4%(934/949),阳性预测值达到了 95%(71/75),证实了血浆cfDNA检测MSI的有效性【39】。基于液体活检的高通量测序是MSI状态评估的潜在检测方法,但因MSI-H在HCC的发生率较低,目前的免疫治疗临床研究中较少使用MSI作为前瞻性或预后性生物标志物。

特定的基因突变

特定基因的突变可能影响肿瘤细胞屈服于或逃避免疫监视的能力【40】。靶向PD-1的抗体对STK11 / LKB1缺陷型NSCLC无效【41】。二线治疗数据表明PD -1 / PD-L1单药疗法在EGFR + / ALK + NSCLC中效果较差【42~45】。全外显子组测序数据和Panel测序数据发现转移性肾透明性细胞癌患者的PBRM1基因的截短突变与免疫检查点治疗的临床获益增加相关,PBRM1编码SWI / SNF染色质重塑复合物的亚基【46】。此外,据报道PTEN失活突变促进了黑色素瘤临床前模型和患者对ICI治疗的免疫耐受【47】。TCGA数据的分析显示,POLE基因突变的存在与高突变负荷和几个免疫检查点基因的表达升高有关,并表明携带POLE突变的癌症患者是免疫检查点抑制剂治疗的良好候选者【48】。通过对17例用抗-CTLA-4和抗-PD-1治疗的转移性黑色素瘤患者的肿瘤样本和匹配的血液样本进行WES检测,发现与治疗应答者相比,B2M LOH(杂合性缺失)在非应答者中的富集且提高了三倍,并且与总体生存期(OS)较差有关【49】。同样,在HCC的免疫治疗中存在特殊的基因突变。研究表明,具有Wnt-β-catenin通路突变的HCC患者对免疫检查点抑制治疗耐受,其中位生存期较差(突变患者的9.1 个月 vs. 突变患者的15.2 个月)【50】。在HCC中,Wnt / CTNNB1突变是免疫排斥亚型的特征,Wnt-β-catenin通路上的突变可能是预测HCC患者对免疫检查点抑制剂耐药的生物标志物。当然,这还需要进行大规模的临床验证。基于特定基因突变对免疫疗法的影响,全面的NGS检测或许可以提供更多关于HCC免疫治疗应答的生物标志物信息。

可回顾“探肝”往期推文:β-catenin激活是HCC免疫治疗潜在耐药Biomarker

HLA分子

抗肿瘤免疫应答的关键步骤之一是抗原呈递细胞(APC)将肿瘤相关抗原呈递给T细胞,T细胞激活机体的细胞免疫系统以清除肿瘤细胞。这一关键步骤由MHC-T细胞受体(TCR)相互作用介导。MHC-I类分子由大多数有核细胞表达,并且主要将内源性衍生的肽抗原呈递给CD8+ T细胞;MHC-II类分子主要由专职抗原呈递细胞(pAPC)如树突细胞(DCs)、B细胞和巨噬细胞表达,并且主要将外源衍生的肽抗原呈递给CD4+ T细胞。MHC复合物在人类中也称为HLA,由6号染色体上的200多个基因组成,可分为三类:I类,II类和III类。HLA-I类由三个基因组成:HLA-A,HLA-B和HLA-C 30;HLA-II类由六个主要基因组成:HLA-DPA1,HLA-DPB1,HLA-DQA1,HLA-DQB1,HLA-DRA和HLA-DRB1。HLA最突出的特征是明显的多态性,多态性的差异决定了患者对免疫治疗的反应。患者HLA- I类的基因型影响患者对检查点阻断免疫疗法的反应。黑色素瘤患者HLA-I类杂合性的存在与ICI治生存期的增加相关;当考虑TMB时,HLA-I类杂合性与生存期延长的关联得到增强;在所有HLA-I类基因座为杂合的黑色素瘤患者中,肿瘤细胞中至少存一个HLA-I的LOH的患者与存活率降低相关(P = 0.05,HR = 1.60,95%CI 1.03~2.43)【51】。表明HLA-I 类分子的胚系基因型,以及肿瘤细胞HLA-I分子LOH(HLA-I分子体系LOH)与ICI治疗相关。而肿瘤特异性MHC-II类分子的表达与抗PD-1疗法反应较优效有关【52】。最近一项研究显示,HLA-C,HLA-DPA1和HLA-F的表达与HCC的预后有关;HLA-A和HLA-DQA1的基因表达与HBV相关的HCC的预后有关;HLA-C可能是HCC的诊断生物标志物【53】。使用NGS技术鉴定HLA基因型和抗原肽-MHC结合亲和力预测也有助于指导选择新的HCC抗癌疫苗靶标选择。

宿主免疫相关基因的遗传多态性

由于部分免疫应答基因的遗传变异性,人们对自身免疫和慢性炎症性疾病表现出不同的敏感性水平。宿主免疫遗传多态性可能会影响每个个体对癌症ICI治疗的有效性。研究分析表明,IL-28B(rs8099917)TT基因型与肝癌复发显著相关,基因芯片分析显示,IL-28B TG / GG基因型的背景肝脏样本中的IFN刺激基因表达高,而肿瘤组织中免疫相关基因高表达【54】。当然,有必要进一步研究HCC患者的整体遗传多态性如何影响患者对免疫治疗的回应。

PD-L1表达

既往众多研究表明,高PD-L1表达是包括包括黑素瘤、乳腺癌、肺癌、膀胱癌、宫颈癌、前列腺癌、食道腺癌、肾癌和血液恶性肿瘤等许多肿瘤的有利预后因素。PD-L1表达水平可作为预测抗PD-1/PD-L1治疗的临床疗效重要标志物。在CheckMate 040研究中,在PD-L1表达≥1%亚组中26%患者观察到客观反应,而在 PD-L1表达<1%的亚组中只有19%的患者观察到客观反应,表明PD-L1表达是HCC免疫治疗的潜在生物标志物。目前在FDA获批的免疫检查点抑制剂中,根据癌种类型,PD-L1表达检测已作为nivolumab和pembrolizumab的伴随诊断。在2979例具有显著的异质性的HCC患者中,总生存期(OS)和无复发生存期(RFS)在PD-L1高表达和低表达亚组之间没有显著差异。同时,临床研究(如CheckMate017和OAK)发现PD-L1表达阴性的患者也可以从免疫疗法中受益【43,55】。通过这些临床研究,我们可以发现肿瘤细胞中PD-L1的表达水平并不是完美的预测免疫治疗疗效的生物标志物。未来的研究将需要评估肿瘤浸润淋巴细胞上PD-1和PD-L1的表达来作为潜在的有价值的生物标志物。PD-L1表达与其他生物标志物(如TMB)结合,对预测免疫疗法的疗效也是发展趋势之一。

肿瘤浸润淋巴细胞

肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)是存在于肿瘤组织中的异质性抗肿瘤淋巴细胞群,包括T细胞、少量B细胞,自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞和树突细胞(DC)。在肿瘤微环境中,TIL受不同细胞激活机制和细胞因子的影响,这可以产生不同的免疫应答。高度浸润的TILs与多种肿瘤的较好的临床结果相关,也越来越多的证据表明TILs的位置、密度和表型影响ICIs的结果。研究发现,CD8 + T淋巴细胞的数量是NSCLC患者免疫治疗的独立预后因素【56】。在HCC患者中,观察到肿瘤浸润的T细胞和B细胞彼此紧密接触,并且它们的密度与较优的存活率相关【57】。总体上,高密度CD8+ T细胞与HCC患者更好的总生存期和无复发生存率有关【58】。一项综合分析显示,在一个或两个肿瘤区域中具有高密度CD3 +和CD8 +细胞的HCC患者其疾病复发率显著降低【59】。目前,单细胞RNA测序(scRNA-seq)平台的应用使得表征TILs成为可能。由于肝脏具有免疫特异性,基于肿瘤中心和肿瘤浸润边缘TILs的频率和分布模式,建立免疫评分系统,从而对HCC患者进行分层,也将有助于筛选免疫治疗获益人群。

共生微生物群

微生物群通过从局部的维持保护屏障的稳态到系统性地调节代谢、造血、炎症、免疫和其他功能,从而影响人体的生理功能,并且微生物群还参与癌症的发生发展和转移【60】。人类的肠道微生物群是由细菌、病毒、真菌和古细菌组成的既复杂复杂又动态的群落,并影响ICIs治疗的功效【61,62】。对粪便样本进行分析的研究发现了特定肠道细菌和在多种癌症中ICI治疗反应之间的关联【63,64】。研究表明,肠道微生物组通过使用胆汁酸作为信使来调节肝脏NKT细胞的趋化因子依赖性积累和包括HCC在内的肝脏的抗肿瘤免疫性,从而调节肝脏肿瘤的免疫监视【65】。在最近的一项研究中,16S rRNA分析显示HBV相关HCC患者的粪便微生物群的物种丰富程度远高于非HBV非HCV(NBNC)相关的HCC患者,NBNC-HCC患者的粪便具有更多潜在的促炎作用的细菌【66】。高通量DNA测序和微阵列技术在组学中的应用,如“宏基因组学”,使我们能够识别整个微生物库和个体肠道微生物群的相对丰度【67】。包括基因组学、转录组学、宏基因组学的多组学组合方法,可以提供HCC的重要病因和致病见解,并可能有助于精准医学。
目前,免疫治疗可以有效延长部分HCC患者的总生存期。为了提高疗效,寻找合适的生物标志物来预测免疫治疗疗效是一个亟待解决的重要问题。目前仍有几个问题需要紧急解决:

(1)除PD-L1表达外,还缺乏对HCC免疫治疗反应的预测性生物标志物。

(2)大多数临床试验侧重于治疗反应的潜在预测生物标志物,但没有可靠的生物标志物用于鉴定治疗相关的不良事件,用于鉴定不良事件的可靠生物标志物在HCC的临床中同样重要。

(3)HPD(超进展)可能发生在用免疫检查点抑制剂治疗的HCC患者中,但目前没有HPD的预测性生物标志物。

(4)中国人群HCC患者HBV感染率较高,更常用中药治疗。同时,中国人群HCC患者具有不同的“驱动基因”突变特征,这些突变可能对免疫治疗产生影响,因此,迫切需要对中国人群HCC患者的特征进行生物标志物研究。

癌症长期以来被描述为基因组疾病,高通量测序技术、多种免疫组织化学技术和其他技术将有效地帮助我们发现新的免疫治疗生物标志物,从而为HCC患者的精准医疗提供指导。

注:UC,尿路上皮癌;NSCLC,非小细胞肺癌;TNBC,三阴性乳腺癌;SCLC,小细胞肺癌;MCC,Merkel细胞癌;CSCC,皮肤鳞状细胞癌;RCC,肾细胞癌;HNSCC,头颈部鳞状细胞癌;MSI-H,微卫星不稳定性高;dMMR,错配修复缺陷;PD-L1 IC,PD-L1在肿瘤区域免疫细胞中的表达;PD-L1 TPS,PD-L1肿瘤比例评分;PD-L1 CPS,PD-L1组合阳性评分。

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