肺癌免疫治疗标志物研究面临的挑战与展望

作者：傅梦姣 周建英

来源：中华结核和呼吸杂志, 2020,43(02) : 87-91.

摘要

肺癌免疫检查点抑制剂（主要为抗PD-1或PD-L1类药物）可显著提升晚期肺癌患者的5年生存率，目前在晚期肺癌一线及二线治疗中占据重要地位，未来将成为肺癌治疗的主要措施之一，而呼吸领域的临床医生对其不良反应还缺乏足够的认识。本文简要介绍肺癌免疫检查点抑制剂治疗的不良反应及其防治。

免疫检查点抑制剂治疗（简称免疫治疗）显著改善了晚期非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者的预后，但仍有超过半数的患者难以从中获益。寻找有效且可靠的生物标志物对于实现精准治疗十分必要。目前有众多标志物可用于肺癌免疫治疗的疗效预测，但均存在不容忽视的局限性。

一、肿瘤相关的生物标志物

1．程序性死亡配体-1（programmed death-ligand 1，PD-L1）表达：

PD-L1是程序性死亡蛋白-1（programmed cell death protein 1，PD-1）的配体之一，多个Ⅱ期或Ⅲ期临床试验结果均表明肿瘤细胞上PD-L1高表达的患者可能从免疫治疗中获得更高的客观缓解率（objective response rate，ORR）、更长的无进展生存期（progression-free survival，PFS）和总生存期（overall survival，OS）^[1,2,3,4]。因此，多种PD-L1试剂盒被批准用于筛选适合免疫治疗的患者，但用PD-L1作为单一预测预后的标志物仍存在不可忽视的缺陷。首先，现有的PD-L1检测方法尚未标准化，众多临床试验采用的免疫组织化学检测试剂盒的抗体、染色细胞（肿瘤细胞、免疫细胞）、染色部位（胞膜、胞内）及临界值均不同，难以将各项试验结果进行整合分析并达到广泛共识。PD-L1免疫组织化学检测法与蓝图项目（Blueprint PD-L1 Immunohistochemistry Comparability Project）的Ⅱ期研究对5种PD-L1检测试剂盒进行了比较，发现22C3、28-8和SP263的检测结果具有高度一致性，但SP142的敏感度较低，73-10的敏感度较高^[5]。其次，部分临床试验中使用的检测标本为存档的肿瘤组织，不能反映免疫治疗前的真实状态。PD-L1的表达呈动态、可诱导性，多种因素如接受化疗、放疗等都可能上调肿瘤组织内PD-L1的表达水平^[6]。再者，患者的多个肿瘤病灶之间，甚至同一病灶内部不同区域之间均存在异质性^[7,8]。活检取材往往取决于操作的创伤程度和组织的易及性，针刺取材可获取的肿瘤组织有限，而局部且有限的肿瘤组织并不能反映该患者的实际免疫表型。肿瘤免疫表型的时空异质性要求患者能够接受动态连续的多部位取材，而这在临床实践中极为困难。

2．肿瘤突变负荷（tumor mutation burden，TMB）:

指肿瘤基因组编码区内的体细胞突变数量，具体定义为：每兆碱基内发生置换和插入或缺失突变的总数^[9]，与新抗原的产生及免疫应答的激活密切相关。高TMB的患者常具有更活跃的免疫应答并能够从免疫治疗中获益。基于CheckMate 026和CheckMate 227两项临床研究结果^[10,11]，TMB作为潜在的生物标志物被美国国立综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）NSCLC指南推荐用于识别适合接受免疫治疗的肺癌患者，但目前对于如何衡量TMB尚无共识。

与PD-L1一样，TMB也面临着肿瘤时空异质性和缺乏标准化检测方法的问题。存档的组织由于核酸的降解可能导致TMB检测结果偏低。全外显子测序（whole exome sequencing，WES）是理想的TMB检测方法，但由于其价格昂贵、费时，不易在临床推广。目前有多个基于二代测序（next generation sequencing，NGS）平台的TMB检测方法（如Foundation One CDx和MSK-IMPACT）已显示出与WES检测结果的高度一致性^[9,12]，但TMB的临界值尚存争论。除数量外，TMB的种类也可能影响免疫治疗的反应，与单核苷酸变异（single-nucleotide variations，SNV）相比，插入或缺失突变产生的新抗原具有更强的免疫原性^[13]，因此，单纯以TMB数量来预测治疗效果未必准确。

微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）是指肿瘤细胞内的微卫星由于重复单位的插入或缺失而导致微卫星长度的改变，是由错配修复（mismatch repair，MMR）基因缺陷导致的。DNA损伤修复功能的缺陷可能导致较高的TMB^[14]，进而增加免疫治疗的响应率。NSCLC患者中MMR缺陷和MSI的发生率极低，不足1%^[15]，故MSI在NSCLC中的应用价值尚不确切。

3．肿瘤浸润淋巴细胞：

肿瘤细胞上PD-L1的表达部分源于致癌信号通路激活导致的内源性表达，另一条重要途径即是通过肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocytes，TIL）分泌的γ-干扰素（inteferon gama，IFN-γ）诱导性表达。根据肿瘤细胞PD-L1的表达和肿瘤组织内TIL的浸润程度可将肿瘤分为4种类型^[16]：（1）PD-L1与TIL均阳性，即'适应性免疫耐受'，该型最可能从免疫治疗中获益^[17,18]；（2）PD-L1与TIL均阴性，即'免疫忽视'，肿瘤微环境内缺乏免疫反应，预后最差；（3）PD-L1阳性而TIL阴性，该型肿瘤细胞上的PD-L1多为致癌信号通路导致的内源性表达，抗PD-1或PD-L1单抗治疗常难以起效；（4）PD-L1阴性而TIL阳性，提示存在由PD-L1外的其他机制导致的免疫耐受。文献报道NSCLC患者中Ⅰ型患者仅占29.4%^[19]，因此，如何联合其他抗肿瘤治疗促进肿瘤抗原的暴露并诱导TIL的浸润，从而改变患者的免疫表型，使其获益于抗PD-1或PD-L1治疗是有待进一步探索的方向。此外，TIL的检测标准尚未建立，且肿瘤的空间异质性也在极大程度上限制了TIL预测的准确性。

4．IFN-γ相关的标志物：

IFN-γ相关信号通路在发挥抗肿瘤免疫效应中至关重要。IFN-γ mRNA基线表达水平高的患者可能获得更长的PFS^[20]；另一项研究检测了与IFN-γ相关的10个基因，结果发现IFN-γ相关的基因表达模式亦可预测免疫治疗的疗效^[21]，反之，IFN-γ下游信号通路的缺陷可导致免疫治疗的失败。对接受抗细胞毒T淋巴细胞相关抗原-4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4，CTLA-4）单抗治疗无反应的黑色素瘤患者的全基因组进行分析后发现，IFN-γ通路上的基因发生了大量的拷贝数变化和SNV^[22]；此外，IFN-γ信号通路上的JAK1/2分子的失功能突变还可能介导了抗PD-1或PD-L1单抗治疗的原发性耐药^[23]。相关研究主要集中在黑色素瘤领域，有关NSCLC患者的数据较为有限，因此IFN-γ相关基因表达对肺癌免疫治疗的指导意义仍不明确。

5．人类白细胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）相关的标志物：

HLA是人类组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）的表达产物，肿瘤细胞表面上存在HLA-Ⅰ类分子，参与肿瘤抗原的处理和呈递，对T细胞识别肿瘤并发挥抗肿瘤效应至关重要。HLA-Ⅰ的基因型可影响免疫治疗的疗效，杂合型HLA-Ⅰ的患者可获得较长的OS^[24]。B2M基因在HLA-Ⅰ的折叠及转运过程中必不可少，B2M基因的截断突变可导致肿瘤细胞表面HLA-Ⅰ的缺失，导致免疫治疗的失败^[25]。

6．肺癌驱动基因：

携带不同驱动基因如表皮生长因子（epidermal growth factor receptor，EGFR）、间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）、KRAS基因等的NSCLC患者免疫治疗的缓解率不同。目前认为，EGFR突变与ALK重排的NSCLC不是免疫治疗的优势人群，EGFR突变甚至与免疫治疗的超进展相关，这部分群体应在靶向治疗失败后再考虑免疫治疗^[26,27]。

7．液体活检：

液体活检即通过检测体液中含有的肿瘤来源成分进行疾病诊断，具有低创伤、可重复等优势，可动态监测患者的免疫状态，克服肿瘤的异质性，有助于免疫治疗策略的调整，实现精准治疗。

肿瘤细胞分泌的外泌体上携带的PD-L1（exosomal PD-L1，ePD-L1）分子可与循环中的免疫细胞（特别是CD₈⁺T细胞）相互作用，抑制其发挥效应，可能是肿瘤免疫逃逸的机制之一^[28]。一项纳入小样本黑色素瘤与肺癌人群的临床研究发现，免疫治疗初期外泌体上PD-L1 mRNA水平的显著下降与肿瘤病灶的缓解相关，但mRNA水平与ePD-L1是否呈线性相关尚不明^[29]。在其他瘤种中ePD-L1也显示了不同程度的预测价值。目前尚未见ePD-L1与肺癌免疫治疗预后关系的大样本研究报道。此外，由于技术和费用问题，ePD-L1的临床应用仍有一段漫长路程。

对两项大型随机对照临床试验的回顾性分析结果显示，外周血中TMB与组织中TMB水平有较高的相关性，在接受抗PD-L1单抗治疗的患者中，外周血TMB水平高的患者可获得更长的PFS和OS^[30]。该结果同时也催生了另一项前瞻性的BFAST研究，探讨基于NGS的外周血TMB是否可作为NSCLC一线免疫治疗的疗效预测指标^[31]。与组织TMB相比，外周血TMB可重复检测并能覆盖肿瘤异质性，具有良好的应用前景。

二、宿主相关的生物标志物

1．外周血细胞数量：

外周血细胞数量在疗程中的变化可一定程度上反映机体免疫状态的动态变化，且具有无创、价廉的优点。研究结果显示，外周血中的淋巴细胞绝对值、中性粒细胞绝对值（absolute neutrophil counts，ANC）以及中性粒细胞与淋巴细胞比值（neutrophil-to-lymphocyte ratio，NLR）等可提示免疫治疗的疗效^[32]。ANC及NLR水平高反映机体存在肿瘤相关的炎症反应，大量未成熟或者低分化的中性粒细胞释放入血与肿瘤进展密切相关^[33]。但外周血细胞数量检测极易受外界因素干扰，可重复性差，难以保证预测的准确性，仅能在部分经选择的人群中作为辅助的标志物帮助判断预后。

2．乳酸脱氢酶：

肿瘤细胞的生长需要消耗大量葡萄糖并产生乳酸，而乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）参与催化此过程^[34]。一项纳入1 136例接受免疫治疗的晚期NSCLC患者的荟萃分析结果显示，治疗前LDH升高的患者PFS和OS相对较短^[35]。尽管LDH的预测准确性及其临界值有待更多的研究结果证实，但由于血LDH测定简单、方便，可与其他标志物联合进行，为免疫治疗的策略调整提供参考。

3．肠道微生态：

肠道微生态参与机体免疫调节过程。文献报道将接受免疫治疗患者的肠道菌群移植到小鼠模型后发现，某些特定肠道细菌可增强免疫治疗的抗肿瘤效应^[36,37]。目前关于肠道微生态与NSCLC免疫治疗疗效的相关性研究较为缺乏。一项纳入了100例接受抗PD-1抗体治疗的肿瘤患者（其中包括60例NSCLC）的研究发现，免疫治疗有效的患者肠道中嗜黏蛋白-艾克曼菌（Akkermansia muciniphila）的丰度显著高于无效患者^[38]。但考虑到肠道菌群的复杂性以及FMT小鼠模型在重建人类微生物菌群过程中可能出现的诸多混杂因素，益生菌制品对免疫治疗人群的作用有待更多的研究结果证实。

目前，尽管PD-L1和TMB仍存在诸多局限性，但仍是目前临床应用最为广泛且被批准用于预测NSCLC免疫治疗疗效的生物标志物，建立PD-L1和TMB的标准化检测方法与确定临界值迫在眉睫。

新型生物标志物的探索应兼顾敏感与超进展两个方向。既往的研究多关注免疫治疗的敏感标志物，以筛选免疫治疗的优势人群。但近年来，免疫治疗耐药基因及超进展相关基因越来越受到关注。JAK及B2M基因突变提示耐药，而MDM2/MDM4扩增、EGFR扩增和位于11q13位点的某些基因如CCND1、FGF3、FGF4和FGF19等扩增的患者在接受免疫治疗后更容易发生超进展现象^[39]。不适用人群的剔除有助于减轻免疫毒性及不必要的经济负担。

未来或可利用人工智能和大数据研究构建多变量预测模型。Rizvi等^[12]发现TMB与PD-L1可能是影响免疫治疗疗效的两个独立因素，而高水平TMB同时PD-L1阳性的患者持续获益率最高。Althammer等^[17]发现在163例接受PD-L1单抗治疗的NSCLC患者中，高TIL密度且高PD-L1表达患者的ORR阳性预测值最高且PFS最长。此外，亦有研究开展了炎性基因特征与TMB的联合研究，结果发现TMB高且具有T细胞炎性肿瘤微环境的肿瘤表型对免疫治疗应答效应更好^[40]。以上研究结果均提示将多因素联合作为一个复合变量时，预测的特异性将大大提高。通过提取大样本、多维度的特征，利用机器学习构建多变量模型，获得预测性最优异的综合性预测标志物可能具有良好的前景。

液体活检及其他无创性检查方法如外周血细胞数量等则可充分发挥其无创简便、覆盖肿瘤异质性的优势，可实时反映机体的免疫状态和肿瘤行为，可用于疗效评估、监测病情、及时发现可能的耐药。除以上的标志物外，循环肿瘤细胞、骨髓来源的抑制性细胞、外周血循环肿瘤DNA、microRNA、可溶性PD-L1、外周血细胞因子等诸多标志物均有一定的应用前景。

利益冲突

利益冲突　所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献：略