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Beyond PD-L1 Markers for Lung Cancer Immunotherapy 针对肺癌免疫治疗探究PD-L1之外的生物标志物 简介： 使用免疫检查点抑制剂进行免疫治疗已成为非小细胞肺癌(NSCLC)患者一线和二线的标准治疗方法。然而，目前还没有适合的生物因子可以准确地预测免疫治疗是否对非小细胞肺癌(NSCLC)患者有效。在前瞻性的临床实验，肿瘤细胞PD-L1的表达水平以及肿瘤突变负荷被用来作为患者使用pembrolizumab(帕姆单抗)和atezolizumab(阿特珠单抗)结合ipilimumab(易普利姆玛)这两种免疫治疗方法来治疗肿瘤的标准。然而，并非所有具有这些预测因子的患者都能从免疫治疗中获益。预测免疫治疗有效性的困难主要存在于生物因子的检测和对检测结果的解释。因此，需要寻找其他的预测因素。目前，对非小细胞肺癌患者肿瘤免疫表型和肠道微生物的识别研究正在深入进行。免疫治疗的有效性与肿瘤中炎症反应的强度、微生物组的多样性以及肠道中某些细菌种类的出现之间的相关性已有被相关提及到。本文的目的是引起人们注意影响NSCLC患者抗PD-L1免疫疗法疗效的因素。 除了PD-L1，我们还需要其他标记，例如TMB（肿瘤突变负担）或微生物，才能更准确地确定哪些患者将从免疫治疗中受益。 1、 免疫治疗在非小细胞肺癌(NSCLC)中的应用 免疫治疗为非小细胞肺癌(NSCLC)患者提供更多的治疗机会。免疫治疗的主要原理是阻断淋巴细胞上的PD-1(程序性死亡1)和肿瘤细胞上的PD-L1(程序性死亡配体1)的结合，或者激活浸润的免疫细胞，进而激活T细胞消灭肿瘤。目前，在欧盟和美国注册了四种用于治疗非小细胞肺癌患者的免疫疗法。这些免疫疗法会用到以下抗体：Nivolumab (抗PD-1单抗)，Pembrolizumab (抗PD-1单抗)，Atezolizumab (抗PD-L1单抗), Durvalumab(抗PD-L1单抗)。尽管免疫疗法在某些患者中可以有效地治疗非小细胞肺癌，并提供持久的缓解，但由于过度刺激免疫系统，使其对患者产生严重的副作用。抗PD-1或抗PD-L1单克隆抗体的毒性通常比化学疗法低。然而，它们可以引起轻微或严重的毒性来影响内分泌器官或大肠和支气管的粘膜。免疫治疗的严重副作用包括与免疫相关的结肠炎、肝炎、肠道肺炎、甲状腺炎、垂体炎等。因此根据通用毒性标准（CTC），特定阶段的毒性需要采取适当的程序，如果免疫治疗产生的毒性大于一定程度，则会停止免疫治疗。此外，免疫疗法可能会在4％至30％的患者中加速肿瘤的进展。目前对于使用免疫治疗的肿瘤患者来说，还有很多无法解释的现象，例如现有的预测因子无法准确的预测肿瘤患者是否适合使用免疫疗法。在NSCLC患者中使用抗PD-1和抗PD-L1抗体进行免疫治疗指征和预测因素非常多样。PD-L1和TMB的表达并不是免疫疗法完美的预测指标。 2、 免疫检查点理论 目前，使用免疫检查点抑制剂的免疫疗法是癌症治疗的新突破，免疫检查点抑制剂主要针对CTLA-4和PD-1。 2.1 CTLA-4 T淋巴细胞激活和细胞应答通过抗原呈递细胞（APC）和T细胞之间的复杂相互作用而发生。用T细胞受体（TCR）识别MHC（主要组织相容性复合物）分子上的抗原尚不足以产生免疫应答。第二信号由APC上的B7家族成员提供。T细胞上的CD28与抗原呈递细胞上的B7.1（CD80）或B7.2（CD86）结合，是T细胞活化的主要共刺激信号。CTLA-4（细胞毒性T淋巴细胞抗原4）与CD28是同源物质，其能与B7.1（CD80）或B7.2（CD86）结合，但CTLA-4与CD-28作用相反，其传递抑制信号给T细胞，进而减弱T细胞活化。 2.2 PD-1和PD-L1 PD-1位于T淋巴细胞，NK细胞和非刺激性B淋巴细胞上，即参与特定免疫反应的细胞。树突状细胞，巨噬细胞和单核细胞在干扰素等因子刺激后可能会表达出PD-1。另外，PD-1的表达还可以通过其他促炎性细胞因子诱导细胞毒性和辅助性T淋巴细胞中PD-1 mRNA的转录而得到增强。当PD-1和其配体PD-L1相互结合时，会给T细胞传递抑制信号，抑制T细胞活化。 PD-L1分子是一种跨膜糖蛋白，主要存在于先天细胞（巨噬细胞或单核细胞）的表面。在健康人群中，这些细胞可能会表现出PD-L1分子的负表达，而在持续的慢性炎症过程中，这种分子的表达会被诱导，这是一种防止T淋巴细胞过度活化的机制(PD-L1与PD-1的相互作用会抑制PD-1阳性细胞的活性)。 2.3免疫检查点用于肿瘤治疗 然而，PD-L1的表达也可能存在于肿瘤细胞中，这一机制使得肿瘤细胞能够从免疫系统中逃逸。如今，使用免疫检查点抑制剂进行免疫疗法的基本思路是防止PD-1和PD-L1或CTLA-4和B7.1 / B7.2相互作用后导致T细胞内抑制信号的传递。因此，使用阻断PD-1或PD-L1分子的单克隆抗体治疗肿瘤成为科学家关注的对象,原理见（Figure 1）。 目前临床上非小细胞肺癌(NSCLC)患者主要采取化疗的方法进行救治，患者在一线治疗中达到了50%的疾病控制，在二线治疗中达到了20-25%，反应持续时间较短，总体生存期约为12个月。而免疫检查点治疗可以提高患者的总体生存率。研究表示在二线治疗中使用PD-1/PD-L1检查点抑制剂NSCLC患者二线治疗中获得更高的生存率和更好的安全性。在一线治疗中，根据PD-L1的表达水平制定不同的免疫治疗方案，有助于提高患者的生存率。在前瞻性的临床实验，肿瘤细胞PD-L1的表达量被认为是判断免疫治疗是否有效的预测因子。然而，关于PD-L1在免疫治疗中的作用，科学家还存在分歧。由于不同的PD-L1在肿瘤细胞和免疫细胞表达的随机化的不同，会对免疫治疗方案产生影响。如，在二线治疗中，pembrolizumab用于任何PD-L1表达的患者，nivolumab和atezolizumab用于肿瘤细胞上有PD-L1表达或无PD-L1表达的患者。有研究表明，PD-L1表达作为免疫治疗的预测因子的临床试验的不同结果可能是由于免疫组化(IHC)检测和评估PD-L1表达的方法存在显著差异。因此，PD-L1在肿瘤或免疫细胞上的表达并不是免疫治疗的理想预测因子。临床试验表明，使用抗PD-1或抗PD-L1抗体进行二线治疗，即使在肿瘤或免疫细胞上没有表达PD-L1的患者，也可能有效，并且，许多肿瘤或免疫细胞上表达PD-L1的患者对免疫治疗缺乏反应。因此，有必要寻找新的预测因子来判断非小细胞肺癌(NSCLC)患者是否适用免疫疗法。高肿瘤突变负荷被科学家认为很有可能成为免疫治疗的重要预测因子，并且在已有临床实验在进行测试。TMB是对肿瘤基因组每个编码区域的体细胞非同义突变总数的定量测量。在免疫检查点抑制(ICI)治疗下，TMB可能会转化为更高的新抗原负荷和产生更多更有效的抗原，进而使得肿瘤细胞与细胞毒性T细胞发生相互作用。多项临床试验和亚分析解决了TMB在ICIs治疗的NSCLC患者中作为预测标志物的潜在作用的问题。在Rizvi等人的一项回顾性研究中，对34名接受pembrolizumab（派姆单抗）治疗的晚期NSCLC患者进行了研究，结果表明，高TMB（≥178非同义突变defined by WES）与更好，更持久的客观反应以及PFS(无进展生存期)获益有关。Peters等科学家研究表明不管PD-L1的表达水平如何，TMB都能够成为非小细胞肺癌(NSCLC)患者免疫检测点抑制(ICI)治疗的预测因子，TMB能够识别在PD-L1低表达或阴性表达亚组中nivolumab + ipilimumab或durvalumab + tremelimumab将受益的患者。然而，TMB有重要的局限性，如测试的周转时间长，需要大量肿瘤细胞进行测试，不同研究的阳性结果的阈值不清楚，但有限的数据证明TMB对ICI联合治疗的患者的OS（总生存期）具有预测性。虽然，目前TMB和PD-L1是判断NSCLC患者能否从免疫治疗获益的最可靠生物标志物。然而TMB和PD-L1作为预测因子，存在诊断问题，这可能会导致无法准确判断患者是否能够使用免疫治疗，进而导致较差的临床效果，因此，需要考虑其它的预测因子。与肿瘤免疫细胞渗透相关的基因组特征以及免疫原性分析可能对分析ICI治疗后的治疗选择和患者预后具有潜在作用。在许多临床试验中，人们不仅要对癌症组织进行病理和分子诊断，而且要对负责抗肿瘤免疫反应的免疫细胞进行分析。评估免疫系统活动参数的方法既可以预测疾病的进程，也可以规划有效的免疫治疗类型，以增加免疫系统功能或调节免疫系统功能。Table2展示应纳入免疫分析的基本测试。通过对肿瘤组织的免疫学检查，可以明确肿瘤的三种基本免疫特性，这三种免疫特性与抗PD-1和抗PD-L1抗体相关。1）免疫炎症表型，即所谓的“热肿瘤”，其特点是存在CD8阳性的细胞毒性T淋巴细胞以及CD4阳性的记忆和调节性T淋巴细胞。此外，淋巴细胞渗透常伴有非特异性反应细胞的存在。免疫细胞在肿瘤组织中产生许多促炎细胞因子和效应细胞因子的能力也可以通过mRNA分析来检测。在这类肿瘤中观察到不理想的或衰竭的抗肿瘤免疫，因此治疗的目的是增强现有的免疫反应。2）免疫排斥表型，其特征是免疫细胞侵入肿瘤的能力不足。免疫细胞不会渗透肿瘤核心，而是保留在基质中。科学家认为这是由强抑制肿瘤微环境产生的吲哚2,3-双加氧酶(indole 2,3-dioxygenase, IDO)或IL-10等免疫抑制代谢产物引起，进而阻断了免疫细胞的活性。因此，治疗目的是逆转肿瘤的免疫抑制作用，并导致预先存在的抗肿瘤反应渗透到基质中。3）免疫沙漠表型，即所谓的“冷肿瘤”，其特征是肿瘤核心或基质中缺乏T细胞。在肿瘤微环境中，肿瘤或趋化因子不释放免疫抑制因子。这种表型可能考虑到先前存在的抗肿瘤免疫的缺失。因此，针对这类肿瘤组织的治疗目标集中于启动新的免疫应答。这种三分法在大多数实体肿瘤中都可以观察到，它与癌症对免疫检查点抑制剂治疗的反应有关。最高的免疫反应率与肿瘤组织的炎症表型有关，但确切的作用机制更为复杂。首先，高浓度的促炎性细胞因子（IFN-γ）刺激PD-L1在肿瘤细胞以及非淋巴细胞上的表达。这增加了对PD-1阳性淋巴细胞的抑制，成为抗PD-1和抗PD-L1抗体的目标。此外，ICI治疗后，现有但受阻的免疫反应得到加强。相反的情况发生在“冷肿瘤”中，那里没有炎症细胞或淋巴细胞，在这种特殊情况下，使用ICI治疗将没有一个合理的解释。然而，PD-L1表达与炎症表型并没有严格的相关性。“冷肿瘤”也可以表达PD-L1。众所周知，PD-L1在肿瘤细胞上的高表达与抗PD-1或抗PD-L1免疫治疗后的重要临床反应有关。但是证据表明，某些PD-L1阴性患者也可能对免疫疗法产生反应。 在许多动物模型的研究中，PD-L1分子的存在不仅对肿瘤细胞有重要意义，更重要的是对宿主免疫细胞有重要意义。Tang等发现，无论PD-L1在肿瘤细胞上的表达状态如何，抗PD-L1抗体都会在肿瘤组织中积累。PD-L1具有对抗原提呈细胞的负性调节和抑制T细胞的功能。最后，肿瘤内部的PD-L1阻断不足以激活T细胞活性，因为T细胞进入肿瘤的转运受损。Lin H等研究发现，在PD-L1或PD-1阴性或免疫缺陷小鼠中，即使在PD-L1过表达的肿瘤中，PD-L1阻断也没有效果。这些研究结果表明，PD-L1在宿主免疫细胞上表达，而不是在肿瘤细胞上，在检查点阻断治疗的疗效中起着至关重要的作用。综上所述，预测治疗结果或明确病人的选择不仅应该基于PD-L1的表达，还应该基于各种炎症迹象。不同的基因标记(肿瘤炎症标记)被用来解释癌症对ICIs的反应或耐药机制。似乎一种更简单的分析，可以在任何肿瘤科进行，所谓的肺免疫预后指数(LIPI)。LIPI结合了治疗前产生的外周血中性粒细胞与淋巴细胞比率(dNLR)和乳酸脱氢酶(LDH)水平，Varga等人进行了相关研究。作者认为，这种经过精确计算的免疫治疗方法可以将患者分为不同的群体，这些群体将从免疫检查点抑制剂治疗中受益。然而，不能排除LIPI主要是一个预后因素，而不是一个预测因素。人肠道微生物组在门分类水平上具有相当稳定的组成。革兰氏阴性细菌是人类胃肠道（GIT）生理微生物组中数量最多的细菌。肠道微生物多样性高，促进巨噬细胞和淋巴细胞分化，促进细胞毒性T细胞活化，上调PD-1在淋巴细胞上的表达。肿瘤患者的微生物组不仅可以在胃肠道（GIT）中检测，还可以在肿瘤和邻近组织中检测（Figure2）肺组织微生物组形成一个独特的集群，大部分与肠道、皮肤、阴道或口腔和鼻腔的微生物组分离。变形杆菌门是在非恶性肺组织手术切除的NSCLC患者中占主导地位的一门(60%)。厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门在非恶性肺组织中占少数。微生物群落多样性随环境暴露(空气污染和人口密度)和吸烟强度的增加而增加。非肿瘤肺组织中细菌种类的数量和多样性明显高于肿瘤组织和慢性支气管炎上皮细胞。重度吸烟者肺微生物组组成(失调)和上皮细胞解体的紊乱可能是慢性阻塞性肺疾病和肺疾病炎症过程的主要原因。有证据表明，反复接触抗生素和由此导致的失调也会增加肺癌的风险。如今，微生物组已作为致病性（破坏细菌代谢产物的DNA）或免疫刺激剂在癌症患者中进行了广泛研究。有机体免疫力取决于肠道微生物组的组成。似乎癌症患者的肠道微生物群可以影响患者对免疫检查点抑制剂免疫治疗的反应。肠道菌群失调可能是引起ICIs耐药的主要原因。已经证明，抗生素限制了ICI对晚期癌症患者的疗效。抗生素降低肠道菌群多样性，导致肠道菌群失调，影响ICIs的有效性。第一次，在黑色素瘤患者中观察到肠道微生物组中特定细菌种类的出现与抗CTLA-4或抗PD-1 / PD-L1抗体的功效之间的关系。Vetizou等人发现，经过抗生素治疗或无菌处理的小鼠体内的肿瘤对CTLA-4阻断剂没有反应。采用脆弱拟杆菌多糖免疫接种克服了上述作用，并对脆弱拟杆菌特异性T细胞进行了过继转导。从人类到小鼠的粪便微生物群移植(FMT)证实，用ipilimumab治疗黑色素瘤患者有利于的脆弱型芽孢杆菌的生长，具有抗癌特性。Botticelli等人研究了用nivolumab治疗的NSCLC患者和健康人的肠道微生物组。这项研究表明，肠道微生物组的原始组成可能会影响对免疫治疗的反应，但是免疫治疗也会影响肠道微生物组的组成。PD-L1在肿瘤细胞上的表达和TMB是唯一用于非小细胞肺癌患者接受一线免疫治疗的分子预测因素。但是，对于一线化疗和免疫疗法联合治疗以及二线抗PD-1或抗PD-L1抗体单一治疗的资格鉴定，不需要任何分子预测因素。事实上，在肿瘤细胞上没有PD-L1表达或TMB较低的患者中，免疫治疗的效果是可以观察到的。此外，有时即使有治疗倾向，ICI治疗也没有反应。PD-L1表达评估和TMB检测的方法还没有明确的定义，因此有必要寻找新的预测因素进行治疗。炎性细胞的存在会影响肿瘤的形成和淋巴细胞产生促炎性因子的能力，可能会提高免疫疗法的有效性。此外，肿瘤的免疫表型可能表明有必要使用不同的免疫治疗方法组合。最后，微生物组的多样性和某些细菌种类的存在可以提高免疫疗法的效力。 患有失调症的癌症患者（例如，经过抗生素治疗后）的微生物组重建可能会使他们对免疫治疗敏感。以上所有这些都说明了强大的个性化诊断和治疗方法的必要性，包括对PD-L1，TMB和微生物组分析的全面评估。这种方法可对患者实施最有效的治疗方并且对患者的副作用相对较低。
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