Microbiome：不同严重程度的冠心病可用肠道菌群和代谢组来鉴别 | 微生物专题

冠状动脉疾病 (Coronary artery disease，CAD)或称为冠心病，是指冠状动脉狭窄、供血不足而引起的心肌功能障碍和（或）器质性病变。CAD根据临床症状、动脉堵塞范围及心肌损伤程度，分为稳定型冠心病(SCAD)、不稳定型心绞痛(UA)和心肌梗死(MI)。近来多项研究提示CAD患者的肠道菌群结构和组成表现出明显的改变，而肠道菌群的代谢物如氧化三甲胺（TMAO）、短链脂肪酸（SCFA）和次级胆汁酸，也会影响心血管病的进展。然而不同类别的CAD患者中的肠道菌群特征仍有待明确。本期介绍的研究对不同冠心病严重程度人群的肠道菌群和血清代谢组学进行了深度的关联分析。

发表期刊：Microbiome

发表时间：2019

研究内容：肠道微生物组和代谢变化与冠心病严重程度之间的关系

影响因子：10.465

实验方法

16S rRNA基因测序和非靶向代谢组（LC-MS/MS）

样本数量与类型

1）发现集：161例冠心病患者和40例健康对照。

2）验证集：25例冠心病患者和12例健康对照。

样本类型

粪便与血清样本

实验设计

图 整合CAD表型、血清代谢组、肠道微生物组进行分析

CAD：coronary artery disease冠状动脉疾病

• SCAD：stable coronary artery disease稳定性冠状动脉疾病

• UA：unstable angina不稳定型心绞痛

• MI：myocardial infarction心肌梗死

ACS：acute coronary syndrome急性冠状动脉综合征

• UA：unstable angina不稳定型心绞痛

• MI：myocardial infarction心肌梗死

表 受试者临床信息

纳入与排除标准

1.纳入标准

连续招募40例健康志愿者和161例住院做冠状动脉造影的CAD患者。CAD组：至少一条主要冠状动脉显示50%狭窄的患者。冠状动脉粥样硬化负荷由两名专业心脏科医生采用Gensini评分进行评价。CAD患者进一步分为三个亚组：1) SCAD，2) UA 和 3) MI。对照组：冠状动脉CT或冠状动脉造影检查显示阴性结果，或被确定为无CAD相关临床体征和症状的受试者。

2.排除标准

患有胃肠道疾病、恶性肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病、肾功能不全（严重肾脏疾病肌酐 > 3.0 mg/dL）、前一年有胃肠道手术史或前三个月使用抗生素超过3天的受试者。

3.样本采集

对于受试者，在入院后第二天早晨抽取外周静脉血。从每例受试者新鲜采集的粪便样本迅速送至实验室，并立即置入-80℃冷冻。

研究发现

1.CAD亚组之间血清代谢组学特征的变化

为鉴定不同 CAD 类别患者的血清代谢组特征，作者通过非靶向LC-MS检测空腹血清样本的代谢组图谱。代谢组图谱（极性离子模式）和脂质组图谱（脂质模式）分别产生了7061个特征和4975个特征。采用交叉比较方案，将CAD的不同阶段与正常冠状动脉进行比较，并相互比较：control vs. SCAD（斑块形成和生长），SCAD vs. UA（冠状动脉稳定性向不稳定性转变），SCAD vs. ACS（斑块破裂和侵蚀），UA vs. MI（心脏事件）。基于代谢产物谱数据的OPLS-DA模型，发现所有CAD患者与健康对照者的血清代谢产物有显著差异。

作者将所有受试者的血清代谢产物分成72个共丰度簇。确定了72个代谢物簇 (40.3%) 中的29个与Gensini评分、狭窄血管数量和cTnI水平显著相关（图1a）。而且，CAD富集的代谢型与CAD的主要危险因素呈正相关，而与胆固醇呈负相关。而对照富集的代谢型通常表现出相反的相关性（图1b）。

通过丰度比较，发现所有CAD阴性的代谢型模块在健康受试者中普遍丰度较高。在CAD阳性相关的代谢型中，Control vs. SCAD，脂肪酰基和羧酸、苯和取代衍生物、异戊烯醇脂类、酚糖苷和氨基酸的代谢发生改变；SCAD vs. UA，未发现有显著变化的模块；UA vs. MI，杂芳香族化合物、类固醇、酚糖苷、酪氨酸和衍生物，和氨基苯甲酸酯降解模块出现升高（图1c）。

综上所述，与健康对照者相比，CAD患者具有显著不同的代谢物谱，并且代谢物水平可能随着CAD严重程度的不同而进一步变化。

图 1 鉴定与CAD发生和发展相关的主要血清代谢产物模块

2. CAD亚组之间肠道微生物组的变化

作者接着通过粪便16S测序，研究CAD亚组中的肠道微生物组的变化。健康对照组和SCAD患者的肠道菌群丰富度和多样性没有显著差异，而UA组表现出比健康对照组更高的OTUs值和更高的Chao1指数。

为评估肠道菌群的整体结构，进行了主坐标分析，结果显示随着冠状动脉AS病理生理过程的加剧，菌群结构和组成差异显著。使用Adonis探讨了肠道菌群变化与宿主特征之间的关系。18个指标与肠道微生物变化显著相关（图2a）

由于细菌在肠道生态系统中以功能群（guilds）工作，作者接下来构建了一个共丰度（co-abundance）网络，其中基于SparCC相关系数，共有274个OTUs被至少20%的样本共享，并将OTUs聚类为24个CAGs。CAD患者的 CAG4、CAG14、CAG15和CAG16较健康对照组显著下降（图2b）。在这些CAGs中的OTUs中，81.6%属于毛螺菌科（Lachnospiraceae）和瘤胃菌科（Ruminococcaceae）（图2c），它们的成员可能通过产生丁酸来防止炎症。

值得注意的是，CAG17的丰度在病情较重的组中明显较高。该CAG包含许多变形菌门系统型，例如克雷伯氏菌（Klebsiella）、链球菌（Streptococcus）、嗜血杆菌（Haemophilus）和Granulicatella，它们是病原体或机会致病菌。

图2 鉴定CAD组间显著不同的重要菌群共丰度组（CAG）

3.多组学网络分析揭示CAD中肠道菌群和血清代谢物之间的关系

随后作者评估了肠道菌群和血清代谢物之间的相关性，以进一步探讨不同CAD严重程度患者的菌群特征。通过Spearman相关系数证明，FDR为5%时，9个肠道菌群CAG与14个代谢模块显著相关，这些代谢模块与Gensini评分、狭窄血管数量或cTnI水平进一步相关，可代表CAD严重程度（图3）。对照组中富集的CAG4、CAG14、CAG15和CAG16与 CAD阴性相关的代谢型呈正相关，如鞘脂类和磷脂酰乙醇胺；但与CAD阳性相关的代谢型呈负相关，如甘油脂类、异戊烯醇脂类和苯衍生物。尤其是CAG4，主要由粪杆菌 (Faecalibacterium) 和罗氏菌 (Roseburia) 组成，与10个血清代谢模块密切相关，这意味着CAG4可能通过与不同血清代谢产物相互作用，以在维持正常冠状动脉生理状态中发挥重要作用。

图3 肠道菌群组成、宿主代谢特征，以及主要CAD表型之间的相互关系

4. 基于CAG和CAD相关代谢型的亚组鉴定和预测

为确定肠道细菌CAG和代谢产物模块是否可被视为区分CAD各个阶段与正常冠状动脉，以及相互之间区分的生物标志物，基于24种CAG和72种血清代谢型构建随机森林模型对CAD不同阶段进行分类，并采用ROC曲线对分类进行检验。作者主要建立了5个模型，即Control vs. CAD、Control vs. SCAD、SCAD vs. UA、SCAD vs. ACS 和 UA vs. MI。模型可以准确地区分CAD患者和健康对照者，如AUC所示，其值高达0.955（图4a）。在区分能力最强的特征中，苯和取代衍生物的影响最大，其次是代谢型如神经酰胺、甘油磷脂、牛磺酸和氨基酸，包括L-亮氨酸和L-脯氨酸（图4b）。

随后，作者招募了与发现阶段相同纳入和排除标准的另一个独立验证队列。验证队列分为对照组12例，SCAD组11例，UA组11例，MI组3例。与发现队列的结果一致，在验证队列中，CAG+代谢物模块的特征可帮助区分CAD患者vs. 健康对照、SCAD vs. 对照、ACS vs. SCAD，和MI vs.UA（图4c）。

图4 肠道细菌CAG和代谢产物可以诊断不同严重程度的CAD

编者说

本研究仍然围绕着肠道菌群、代谢物与CAD的关联性展开探讨，重点放在了诊断标志物的鉴定，未涉及因果性的论证。作为一项发到《Microbiome》的肠道菌群工作，有这样一些研究亮点值得大家借鉴。

1.已有的一些研究报道，基于分类学进行菌群功能研究是存在不足的，因为同一个属或种的细菌，其功能可能是不同的，细菌的功能是菌株特异性的。本研究是以共丰度群（CAG）为单元进行菌群的功能讨论，及核心菌的鉴定。

2.既往的与CAD相关的肠道菌群研究仅限于病例对照研究，本研究探讨了CAD亚组（不同的严重程度）中肠道菌群和血清代谢物的变化，并阐释了肠道菌群变化与CAD严重程度相关可能是通过血清代谢物来介导的。

3.本研究通过发现集和验证集的检测，使得CAG和代谢物作为CAD亚组诊断标志物更具说服力。

参考文献

Liu H, et al. Alterations in the gut microbiome and metabolism with coronary artery disease severity. Microbiome. 2019, 7(1):68.