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原创 2017-10-11 订阅号APExBIO 近日，来自法国国家科学研究中心（CNRS）的研究团队发现， TYRP1 mRNA，除了编码TYRP1，还可以有效地扣留（sequestering）miR-16。miR-16被扣留后不能够抑制其mRNA靶标，例如RAB17 mRNA。由于RAB17促进黑素瘤细胞的增殖和肿瘤生长，因此miR-16无法再发挥肿瘤抑制活性。通过沉默TYRP1或增加miR-16的表达，可以在体外恢复miR-16的肿瘤抑制功能。重要的是，利用小寡核苷酸掩蔽TYRP1 mRNA上的miR-16结合位点也可以阻碍TYRP1对miR-16的扣留。miRNA异位成为黑色素瘤新的靶向治疗方向。该结果发表于《Nature Cell Biology》。
MicroRNA（miRNA）是一类小的（〜22个核苷酸）的非编码RNA，在许多生物过程和疾病中起关键作用，包括瘤形成。
miRNA指导沉默Argonaute蛋白复合体到信使RNA靶标以引发转录后抑制。当编码蛋白质的基因在细胞内处于活性状态时，其信息会从DNA形式转录为信使RNA(mRNA)。如果一切顺利，这些编码的mRNA信号会通向细胞的蛋白质制造工厂，在那里用它作为模板合成新的蛋白质。miRNA通常靶向一个或者多个mRNA，通过抑制翻译或降解靶标mRNA来调节基因的表达。 
图1▲ 来源于网络
miRNA种子序列（核苷酸2至7）与mRNA的miRNA反应元件（MREs，miRNA response elements）之间的完美碱基配对可抑制mRNA翻译并介导mRNA衰减。不完美的种子配对也是有效的。除了导致转录后抑制的这些miRNA-mRNA相互作用之外，很多研究已经鉴定了大量非典型结合位点，这里称为非典型MREs。最近有两个meta分析证实非典型MREs可以与miRNAs有效地相互作用。第一项研究认为这些非典型结合位点是“非功能性的”，因为它们不介导mRNA衰减并且没有序列保守性的表现，第二个研究鉴定了几种不同类型的非典型结合位点可以下调mRNA表达。
开发用于研究体外和体内特异性miRNA生物学功能的常见方法之一是利用称为miRNA海绵（miRNA sponge）的人造外源DNA构建体。miRNA海绵含多个靶miRNA结合位点，从而特异性抑制靶miRNA并去抑制靶miRNA的RNA靶标。也就是miRNA海绵吸满了miRNA，这样miRNA就无法与其天然靶点结合。因此，miRNA海绵是有效的miRNA抑制剂。最近，有研究描述了一些内源性miRNA海绵，包括环状RNA。类似地，循环RNA包含数十种单个miRNA的典型MREs，并且显示出对miRNA介导的RNA衰变的抗性。
RNAs对 miRNA的扣留可能具有重要的生理和病理功能。然而，这些RNAs竞争者包括天然miRNA海绵和非规范MREs仍然很大程度上是未知的。
作者之前证实，转移性黑素瘤（melanoma）活检中酪氨酸酶相关蛋白1（TYRP1， tyrosinase-related protein 1）的mRNA表达升高与患者的总体生存期差相关联。也证实，单核苷酸多态性（SNP）rs683，位于TYRP1 3’非翻译区（3’UTR）上的一个MRE-155中，强烈地减少miR-155诱导的衰减，从而导致TYRP1 mRNA水平的升高。然而，TYRP1 mRNA与转移性黑色素瘤患者生存的分子机制仍然是未知的。
在这里，作者发现高水平的TYRP1 mRNA促进转移性黑色素瘤细胞的生长。使用小发夹RNA（shRNA）或短干扰RNA（siRNA）来沉默（KD）TYRP1 mRNA，均阻碍了501Mel，ME1402和Mel624等黑素瘤细胞的增殖。同样，沉默TYRP1 mRNA显著抑制小鼠肿瘤的生长。在这些实验条件下无法检测到TYRP1蛋白，细胞增殖和肿瘤生长与TYRP1蛋白的水平无关。这些数据表明，TYRP1 mRNA除了行使蛋白质编码功能，还可能发挥非编码生物学功能。
那么TYRP1 mRNA是否可以作为天然的miRNA海绵来遏制miRNA的肿瘤抑制活性呢？
为了鉴定TYRP1相关的miRNAs，作者将TYRP1的3’UTR用作RNA免疫沉淀实验中的诱饵。使用TaqMan低密度阵列（800个miRNAs）纯化和定量免疫沉淀的miRNAs。发现两种miRNA（miR-155和miR-16）显著富集，独立于表达水平。TargetScan，一种根据miRNA种子区域及其靶标之间的完美序列匹配来预测miRNA靶标的计算方法，无法在TYRP1上检测到MRE-16。相比之下，基于热力学的RNA杂交算法，鉴定了三个推定的MRE-16以及先前验证的三个MRE-155。
图2▲ 三个MRE-16
鉴定的MRE-16没有显示针对典型miR-16靶标的前排GCUGCU基序（motif），表明存在非典型碱基配对。在合成miR-16的存在下，TYRP1 mRNA水平增加了，而miR-155的存在诱导了TYRP1 mRNA的衰减。同时，合成的miR-16增加了嵌合miRNA传感器的荧光素酶活性，传感器含有与荧光素酶编码序列融合的TYRP1非典型MRE-16序列。这些结果表明，尽管miR-16与TYRP1 mRNA相互作用，但是miR-16不诱导TYRP1 mRNA的衰减。miR-16是肿瘤抑制miRNA，作者假设TYRP1 mRNA的高表达水平可以扣留miR-16以限制其肿瘤抑制活性。实验发现沉默TYRP1导致显著的细胞密度降低，这种作用是miR-16依赖性的，可通过转染miR-16抑制剂来逆转。合成的miR-16可有效降低小鼠黑素瘤细胞的增殖。这些数据表明TYRP1 mRNA是有效的miR-16海绵。 
图3▲ TYRP1 mRNA是有效的miR-16海绵
miRNA海绵“吸取”特异性miRNA的功效不仅取决于miRNA结合位点的数量和亲和力，还取决于海绵吸取miRNA水平的丰度。鉴于每个TYRP1 mRNA分子显示三个非典型MRE-16，整个miR-16池可以潜在地被每个细胞扣留。在等摩尔水平下，合成的miR-16消除了miR-155诱导的TYRP1 mRNA的衰变。重要的是，在黑素瘤活组织检查中，miR-16以比miR-155更高的水平表达。这些数据表明内源性miR-16否定了miR-155对TYRP1-A（A等位基因）的作用。因此，黑素瘤中TYRP1的表达水平及其相关的miRNA海绵活性与SNP rs683和miR-16的水平密切相关。
肿瘤抑制因子miR-16是若干调节细胞增殖的下游靶标如RAB17和NRTN的上游调节因子。miR-16的异位表达显著降低RAB17，MAFF和NRTN的表达。重要的是，在191例转移性黑色素瘤样本中，RAB17水平与TYRP1水平呈正相关。实验发现RAB17的沉默显著降低免疫受损小鼠中移植肿瘤的生长。
作者用称为靶位点阻断剂（TSB）的小反义寡核苷酸来阻止TYRP1结合miR-16。TSB-T3增加了miR-16活性，并降低了两种黑素瘤细胞系中RAB17的水平和细胞密度。TSB-T3处理的小鼠的肿瘤体积显著减小。这些数据强烈表明，TSB-T3掩盖了TYRP1上的MRE-16，并将miR-16重定向到RAB17 mRNA。 
图4▲ TSB-T3掩盖了TYRP1上的MRE-16 
图5▲ 恢复miR-16活性后抑制肿瘤生长
总之， TYRP1 mRNA通过扣留miR-16并抑制其肿瘤抑制活性而在黑素瘤中表现出非编码功能。扣留的miR-16不再能够抑制其参与细胞增殖和肿瘤生长的靶标。因此得出结论，TYRP1通过扣留miR-16间接地调节黑素瘤的生长。TYRP1 mRNA作为一个强有力的miR-16海绵，具有三个属性：首先，TYRP1在大多数黑素瘤中高表达；其次，SNP rs683决定了TYRP1 miRNA海绵的活性。第三，非典型的miR-16结合位点扣留miR-16。该发现也为通过使用TSB作为创新治疗分子创造了更多的机会。
原始论文： A non-coding function of TYRP1 mRNA promotes melanoma growth. Nature Cell Biology. Published online 9 October 2017.
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