CAR-T细胞免疫治疗展望

嵌合抗原受体（CAR）T细胞已经在那些化疗失败的肿瘤患者治疗中取得了成功。CAR-T细胞的发展经历了几十年的历程，从20世纪80年代末,首次提出这项技术，到2017年诺华的tisagenlecleucel获得美国食品和药物管理局(FDA)批准，这预示着一个数十亿美元产业的出现。1993年首次报道了CAR,Eshhar 等人成功的将T细胞的毒性潜能与单链抗体的特异性靶向作用结合了起来。第一代CAR将抗体单链可变区与FcRγ或CD3ζ信号结构域连接了起来。虽然经这种受体转导的T细胞表现出抗原介导的激活，但第一代CAR-T细胞在实体瘤中的早期临床试验令人失望。随着时间的推移，研究的深入，发现CAR基础结构的优化显得尤为重要，这其中就包括增加共刺激结构域来改善T细胞的激活和持续存活时间，以及筛选鉴定使用更加适宜的抗原靶点，最著名的要数CD19。这些研究都取得了积极的临床治疗效果，包括报道的治愈了B细胞恶性肿瘤患者。

对CAR-T细胞设计和递送范围的进一步优化提升了CAR-T用于更多恶性肿瘤治疗的希望，这也预示着开启了肿瘤治疗的新篇章。尽管研究人员，医生，患者，投资者似乎已经被CAR-T的疗效折服，但是，CAR-T治疗仍然有许多重要的问题需要攻克。对于大多数血液癌症患者，以及几乎所有的实体瘤患者，CAR-T细胞还没有证明其有效性，毒性太大，或者由于费用或地理位置的原因使得CAR-T治疗只能惠及极小部分患者。这篇展望性文章旨在综述我们目前CAR-T治疗所处的阶段，考虑哪些亟待解决的问题，以及未来的方向，为将来的成功指明道路。

CAR技术无论在生物技术，还是经济上都是强有力的工具。伴随权利而生的是责任，以及欧洲人血液协会（EHA）和其它兄弟组织。通过支持科技进步，与政府和生物技术行业的领导在医学专业、临床试验、教育、培训和患者宣传方面进行国际合作。2019年，欧洲血液协会（EHA）旗下杂志HemaSphere 出版了一系列综述文章，讨论当下CAR-T治疗的潜能，存在的问题，以及未来的发展方向。这篇文章发表时，EHA正与欧洲血液和骨髓移植协会联合，将在这一方向迈出另一重要脚步。首次在欧洲巴黎召开CAR-T细胞会议。取代化疗治疗B细胞恶性肿瘤将被提上日程。未来，如果我们能雄心勃勃地应对利用CAR-T细胞治疗其他恶性肿瘤的挑战，并确保根据需要而不是根据支付能力获得全球治疗，让更多的患者获益，我们将得到更大的回报。

现状

大多数CAR-T细胞临床试验都是针对早期B细胞瘤。临床试验活跃度在2016年显著增加，每年以100项新增注册临床试验的速度递增。这些试验大多数靶向CD19, 绝大多数为单一靶点，但是结合其他靶点的治疗也在逐渐增加（图1）。虽然有重要的国际合作，但绝大多数试验集中在北半球，这其中绝大多数在美国和中国登记（图2）。仅在美国，就有超过1000名患者接受了CAR-T细胞移植，一些研究已经开始关注反应者的长期响应。

越来越多的数据证明了抗CD19 CAR-T细胞治疗B细胞恶性肿瘤的疗效和持久性。急性淋巴细胞白血病(ALL)的应答率在68%到93%之间，在慢性淋巴细胞白血病中，应答率为57% - 71%，在B细胞淋巴瘤中应答率为64% - 86%。来自ZUMA1研究的长期随访数据表明，少数完全缓解的患者有持久的反应。未来的工作是更好的预测和确定响应率，改善风险-效益平衡，最小化个别患者和医疗保险系统的财政支出。这可能最终导致那些化疗响应差，但是对CAR-T响应好的患者第一时间得到治疗。

尽管临床试验响应率令人振奋，但是要将这些数据应用在现实众多患者中仍然具有很大挑战，部分原因是纳入标准有利于更好的预后。考虑到部分较多身体不适、炎症生理特征更强的患者中，细胞因子释放综合症的几率增加，结合产品制造所需的2 - 3周内疾病进展的风险，试验基本上排除了快速进展或有症状的疾病患者，那些预后反应不佳的患者，炎症标志有所提高，表现出发烧、细胞减少或肝肾生化紊乱。在1个治疗中心所研究的具有化疗可分型的弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者中，只有不到一半患者符合入组ZUMA1研究的资格标准。符合条件的患者接受免疫化疗的存活率明显高于不符合条件的患者。这种倾向性的试验对象人群造成了一个错误的分母问题，潜在地夸大了疗效，并低估了当前产品的毒性。因此，CAR-T的益处相对大小甚至在表达CD19的恶性肿瘤中仍然不是百分百确定的。随着未来在制造和产品周转时间上的改进，以及CAR-T设计和CRS管理的改进，临床试验应该能够更好地包括更多有代表性的患者。

到目前为止，只有一项开放性随机研究，这将更好的建立CAR-T细胞在现有B细胞恶性肿瘤中潜在治疗方法的地位。然而，CAR-T在其他血液恶性肿瘤和实体瘤治疗领域仍然需要很长的路要走，尽管在骨髓瘤瘤和其他实体瘤潜在治疗靶点上有很多试验正在开展，有望在将来填补在实体瘤治疗领域的空白。                        

图1.CAR-T注册临床分析

图2.CAR-T临床注册分布图

未来展望

由于各种原因，表达CD19的血癌似乎最有利于CAR-T细胞治疗。高水平的肿瘤抗原的表达，使得CAR-T细胞经过血液和淋巴系统更容易的接近肿瘤细胞，再生B细胞对脱靶效应的耐受性使得针对CD19 CAR-T成了独特的项目。然而，所有诊断为CD19表达的恶性肿瘤患者中，仅有﹤5%患者适宜获准的CAR-T治疗。因此，需要开发新的治疗策略以应对CD19表达的恶性肿瘤，废除抗原阴性病情复发，改善杀伤肿瘤效率，提高CAR-T持久性，增加对活性和毒性的控制，与此同时，努力将CAR-T治疗应用于其他疾病治疗领域，现在，我们将持续关注CAR-T在治疗其它血液肿瘤和实体瘤治疗领域面临的技术，理论，经济上的挑战，并将持续关注在该领域的创新和未来前景。本节中讨论的一些未来挑战和可能的解决方案见表1。

表1.CAR-T未来发展的挑战

骨髓瘤

从早起数据来看，靶向B细胞成熟抗原（BCMA）在骨髓瘤瘤治疗领域很有前景。BCMA在几乎所有骨髓瘤病例中均有表达，在造血干细胞或非造血细胞中不表达。摘要报告中显示，在少数病情严重的预处理患者中，总反应率高达80%。首次发表的接受抗BCMA CAR-T细胞治疗的患者的试验数据报告了16名受试者，平均9.5个月的CAR-T优先疗法，其中13人有反应，11人至少有很好的部分反应，总的无事件中位生存期为31周。虽然，抗BCMA CAR-T细胞治疗，受试治疗人数少，随访时间短，仍然不知道最终治疗影响有多大，但是，一个强有力的治疗概念论证已完成。随着这项技术的不断改进，以及早期治疗患者生命的延续，我们将看到更加深入和持续的反应，以及对治疗标准的改变。

其它靶点治疗也在探索中，包括CD19,CD38,CD138,SLAMF7,以及靶向κ轻链治疗κ轻链受限的骨髓瘤。以CD138为靶点CAR-T的临床有效性概念论证已经通过CD138裸单抗药物Daratumumab 得到证实，但到目前为止anti-CD138 CAR-T 的进展受限于脱靶效应，因为CD138在红细胞、唾液组织、肝脏和皮肤上表达。由于骨髓瘤的克隆异质性，以及化疗引起的克隆潮的转移，因此，组合抗原靶向治疗显得尤为重要。Mikkilineni和Kochenderfer回顾了去年CAR-T细胞治疗血液骨髓瘤的进展。

尽管最近取得了进展，但骨髓瘤仍然没有可治愈的化疗方案，CAR-T细胞有可能突破现有治疗方案。与之相反的是，非细胞免疫疗法的创新，如抗体-药物偶联物和双特异性抗体疗法，似乎注定会带来激烈的竞争，而且可能会被证明要便宜得多

恶性髓性肿瘤

异基因造血干细胞移植在急性髓系白血病(AML)和骨髓异常增生中的治疗潜力早已证实了T细胞介导免疫治疗在这些疾病中的概念，但将这一概念扩展到CAR-T细胞治疗的应用中存在几个主要问题。显著的患者间和患者内遗传和表型异质性意味着没有独特的AML抗原靶标。此外，在正常健康的骨髓前体细胞上表达的AML抗原，在激活CAR-T细胞后，存在延长和潜在的致命性骨髓消融的风险。骨髓抗原在非造血组织上的表达可能会产生额外的脱靶效应。例如CD33在肝脏Kupffer 细胞中有表达，因此，以CD33为靶点的抗体偶联药物gemtuzumab ozogomycin 具有公认的肝脏毒性。长期持续的anti-CD33 CAR-T 治疗可能会增加肝脏毒性的风险。

有几个策略可以克服这一阻碍，包括（1）鉴定白血病发生和维持所需的AML特异性抗原，可通过组合抗原加以利用；（2）通过自杀式或瞬时CAR表达实现一旦病情缓解及早终止CAR-T活性；（3）清除骨髓的CAR-T细胞治疗后再进行异体造血干细胞移植。到目前为止临床前研究开发的靶抗原包括CD33,CD123,Lewis-Y, CD44v6, FLT3 受体，CLL-1,叶酸β受体。仅有几项正在进行早期临床研究，迄今为止，公开的数据很少，需要进一步了解相关信息，读者可以参考Sarah Tasian’s 教授的综述。

T细胞恶性肿瘤

开发针对T细胞恶性肿瘤的有效CAR-T细胞将是一个巨大的挑战，因为化疗很少能治愈T细胞恶性肿瘤。特别的，独特的障碍包括携带CAR的恶性T细胞污染自体CAR-T细胞产品，以及CAR-T导致的同族CAR-T细胞(同族相残)和健康T细胞因共同的靶抗原而死亡。这一迷人的挑战在Marion Alcantara和 Carl June 一篇简短精炼的综述中已有描述。针对以上问题提出的解决方案包括更换CAR的载体细胞，CAR-NK似乎非常具有吸引力，在早期关于T细胞恶性肿瘤和其它癌症的治疗中显露头角，这一前景光明的新兴领域还有待进一步的数据来证实。

实体瘤

虽然免疫检查点抑制剂已经证实了激活T细胞对实体瘤的疗效，但使用针对单一抗原的第一代、第二代和第三代CAR-T细胞产品治疗实体瘤的结果非常令人失望。在转移性疾病治疗选择很少的领域，显然有大量的临床需求没有得到满足，但遗憾的是，从CAR-T细胞获益的患者比有关这一主题的综述文章要少。其中，Long等人发表了一篇权威文章，概述了进展的具体障碍。

在实体瘤治疗领域，目前针对多种抗原靶点的早期CAR-T治疗临床研究令人眼花缭乱。这既反映了该领域的生物多样性，也反映了迄今为止缺乏有说服力的数据支持任何一种CAR-T细胞产品对抗任何特定的实体肿瘤或肿瘤抗原。与血癌相比，这些令人失望的结果似乎有一些共同的原因:（1）CAR-T细胞很难接触到位于血管化程度较低的肿瘤块内的靶细胞，这些肿瘤块在一定程度上被非恶性炎性细胞和结缔组织隔离。（2）进入实体瘤内部后，输注的CAR-T细胞将面临一个充满敌意、低氧和抗炎的肿瘤微环境，极大地降低了它们潜在的细胞毒性。（3）对于那些成功穿透实体肿瘤并保留细胞毒性潜能的CAR-T细胞来说，还有一个更根本的问题，即缺乏理想的单抗原靶点。不仅缺乏普遍表达的肿瘤抗原，而且缺乏特异性，抗原在肿瘤和对应的、非冗余的、健康的组织上具有共通性。

CAR-T细胞设计的改进提供了渗透和对抗免疫抑制微环境的潜力，一些试验正在进行，这些试验借助放疗，表观遗传学疗法增加肿瘤相关抗原的表达，以扩大CAR-T治疗疗效。CAR-T细胞在实体肿瘤中最现实、最有效的作用可能还不是作为一种单独的治疗，而是深化或维持化疗、放疗或手术诱导的具有高复发风险的疾病的缓解。

似乎我们还没有意识到CAR-T细胞疗法对实体瘤的临床益处，只是简单地重复血癌使用的技术，仅仅通过找到合适的单抗原靶点并将其整合到第三代CAR-T细胞中实现实体瘤理想的治疗疗效是不太可能的。我们需要更复杂、更新颖的方法。随着实体癌症治疗水平的提高，代表着一个巨大的未被满足的需求领域，以及一个对投资者来说可能有利可图的市场，目前解决这些问题的努力应该会产生一些有趣的结果。

下一代CAR-T细胞

在CAR-T细胞技术设计上有各种各样的创新，旨在改善血液恶性肿瘤的疗效和降低毒性，并应对实体癌症的挑战。图3展示了CAR设计的进化历程，随着结构的复杂化，在功能上更加精细化。在最近发表于本杂志的一篇综述文章中对此进行了更详细的讨论。

值得关注的一种方法是多靶向抗原，以增加特异性，捕获多种肿瘤克隆，减少抗原阴性的复发。这导致了逻辑门控T细胞的出现，基于布林逻辑的AND,OR,NOT概念的门控设计T细胞。通过增加AND门控，T细胞只有在两种抗原共存的情况下激活T细胞，最大限度的减少脱靶效应，而NOT门控则是在一种抗原存在，另一种抗原不存在的情况下才会激活CAR-T细胞。OR门控的CAR-T或靶向抗原1，或靶向抗原2，可以最大限度的根除肿瘤多克隆细胞，减少抗原阴性复发，该方案可以通过注入2个CAR- T细胞的不同群体，将2种CAR转导进同一细胞，或者通过新型串联CAR来实现。基于以上原理的CAR-T设计正在进行临床研究，第一阶段的一些数据已经公布，大量的实验主要结合CD19和CD22两个靶点。随着基于适配器的UniCARs或Zip CAR的开发，进一步增加了CAR设计灵活性的潜力。这些模块化的受体使新抗原在出现时有可能成为靶标，结合新抗原预测的新工具可能使我们在恶性肿瘤的发展中保持“领先一步”的能力。

第四代武装化的CARs运用各种技术对抗免疫抑制微环境。这其中包括释放细胞因子的TRUCKs(T细胞重定向的普遍细胞因子杀伤)，这其中最好的例子是其中研究最好的例子是在遇到目标抗原时分泌IL-12，从而改变了肿瘤微环境，有利于免疫激活和肿瘤细胞杀伤。进一步的发展使得恶性肿瘤微环境被用来引导和激活CAR-T细胞，通过添加趋化因子受体来帮助运输，或在缺氧状态下感觉和激活CAR-T。

从理论上讲，增强CAR-T细胞的免疫激活潜能会增加免疫介导毒性的风险。这个问题已经通过添加自杀开关得到解决，当需要快速清除CAR-T细胞时，可以触发自杀开关。这一原理已经拓展为CAR开关，该设计中，CAR的表达依赖于药物诱导，该设计赋予了对CAR-T激活外在的控制，对CAR-T的响应和毒性根据临床需求进行相应的控制。理想的方法可能是复制适应性免疫系统的正常行为，即CAR-T细胞对恶性疾病做出反应，并在缓解期有效消失，而且在疾病复发时，当目标抗原重新出现时再次增殖和激活。

图3.CAR设计：CAR技术新进展

除了在结构设计上的变化，利用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑的进展允许CAR基因转座在特异的基因位点，在增加有效性的同时降低相关的基因突变。这项技术还允许去除“不想要的”基因，如抑制信号或自我表达的目标抗原（例如在T细胞恶性肿瘤中）图4结合上面讨论的一些特性推测未来理想的CAR结构。

CAR-T细胞治疗领域不会孤立的发展。很可能最好的肿瘤响应和维持需要定制针对疾病或患者特异性的CAR-T治疗结合小分子治疗，免疫调节，化疗，基于抗体的治疗等多种治疗的协同作用。目前已经有几项试验在进行中，这些试验不提供特定的CAR，而是针对一些可能的抗原靶点设计CAR，这些抗原靶点取决于病人疾病的免疫表型。很明显，在个性化医疗时代，需要复杂的随机对照研究来确定组合这一系列治疗选择的最佳方式。

图4.CAR设计：理想化的CAR

CAR-T制造

与CAR设计和工程化同等重要的是CAR制造技术的改进将为CAR-T的广泛使用提供了可能。目前集中的体外加工和制造往往在遥远的地点，增加了时间、成本和后勤复杂性。这一过程的改进应能使更多的患者即那些远离当前生产中心的患者，以及那些资源较差的环境中的患者，也能获得更快速的疾病诊断与治疗。及时的CAR-T生产运用像台式封闭盒加工系统平台，例如美天妮的CliniMACS Prodigy T cell 转导平台可以显著的大众化，自动化CAR-T生产进程。在一个理想的流水线式过程中，白细胞被添加到一个封闭机器中，从这个机器中可以选择所需CAR的多种不同特性，几天后就会出现一个CAR-T产品。进一步说，CAR-T细胞的产生可以在体内实现，将T细胞靶向的转基因和转移载体直接注入患者体内除了技术可行性方面的挑战外，这还会带来重大的安全和控制问题，但前景十分诱人。

解决这个问题的另一种方法是使用异基因CAR-T细胞。为降低排斥反应或移植物抗宿主反应风险而编辑的现成产品可迅速使用，也可用于那些无法获得足够质量或数量的自体细胞的患者。个性化产品的范围可能会受到限制，功效和安全性还远远没有建立，但潜在的可用性和大规模批量生产的能力的速度可能最终会减轻现有自体血产品的巨大经济负担。

资金考量

伴随两种FDA获准用于治疗ALL和DLBCL CAR-T产品的尚持，CAR-T产业正在快速增长。我们有理由认为这种经济刺激助长了CAR-T治疗的炒作。生物技术公司已经吸引了数十亿美元的投资，前提是CAR-T细胞产品将在商业上获得成功，但是，这不应偏离我们作为治疗决策依据的客观评估证据。如果这种治疗方法能够实现它的可能性，届时将有一场政治讨论，主题是这种有效的治疗方法究竟该是富人享有的特权，还是需要治疗的人该享有这种权利。

毫无疑问，这也是一个充满巨大机遇的时期。如此巨大的财政投资可以为科学界提供巨大的资源，以实现这一新兴领域的潜力，并推动在癌症基础研究和免疫学方面的相关发现。在平衡预期的同时，投资和获利在医疗保健领域不是一个新问题，CAR-T所吸引的财政投资和带来的空前的治疗巨变赋予监管人士，政治家，经济学家，患者维权组织重要的角色，要求他们与生物公司，研究人员，临床医生合作，提供一个经济上可持续的、公平、安全和有效的CART治疗产业。

结论

经过近30年的发展，CAR-T细胞疗法的兴起在一定程度上是不可避免的。这一领域令人眼花缭乱的变化步伐给监管机构和医疗服务提供商带来了挑战，他们需要在正确的时间为正确的患者选择正确的CAR-T产品，并可能与其他现有和新兴的疗法进行正确的结合。在某些化疗耐药的B细胞恶性肿瘤治疗中显著地反应引人注目，但这不能代表来自于与标准治疗头对头对比长期随访的可信数据。在这方面，CAR-T疗法的附加价值甚至在表达CD19的血癌中也未被量化，而它们在其他疾病治疗中的地位也未经证实和实验。成本和获得FDA批准是产品的两个大问题。日益激烈的竞争以及技术和物流的精简化应该会转化为更亲民的价格，尽管事实并不总是如此，即使是更老的主流药物也是如此。

通过增加免疫系统的复杂性来调整、增强和协调免疫系统，从而提供精确、动态、准智能的生活疗法，这远远超出了传统治疗方法所能达到的水平。仅从概念上来说，这就证明了巨大的希望。我们现在的挑战是为了我们的病人实现这一希望。

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