 本FITC标记试剂盒提供了FITC快速标记所需全部试剂，用于含有伯氨基（NH2-）的蛋白/抗体/多肽或者其他大分子的标记,待标记物上的赖氨酸残基的游离ε-氨基可与FITC 发生亲核反应,形成硫脲连接而共价结合,形成的偶联物的稳定性很好，其反应原理如下:
FITC清除指示剂为蓝色，其为FITC的结构类似物，其数量为加入的FITC的20倍以上，在通过超滤管离心清除游离FITC的时候，如果超滤管中没有蓝色了，游离的FITC基本上被清除完毕。
产品特点： l通过离心脱盐和去除游离的FITC,无需透析或者凝胶过滤； l本试剂盒配备指示剂，确保游离FITC去除完全; l 使用方法简单，无需额外准备试剂. FITC标记使用量的计算： 每个反应中FITC试剂的使用量取决于待标记蛋白质氨基数目和总量。例如,通过我们实验数据分析表明,标记2mg/ml 的抗体（IgG ，150KD）,每毫升抗体溶液（2mg/mL）加入100µL的FITC(2mg/mL) 能达到最佳标记效果效果;其他蛋白的标记可以根据实际情况,参照此比例类推。 实验前准备： 1.仔细阅读使用说明书。 2.提前20min 从冰箱中取出试剂盒，使试剂盒各组分平衡至室温； 3.用FITC助溶剂（DMSO，使用前需要放在室温融化）溶解FITC。 特别提示： A.溶解的活好FITC最好一次性使用完，如果使用不完可以密封放在-20℃的冰箱内，一周内可以使用，但是标记效率会降低； B.FITC助溶剂使用完之后需要立即密封保存，防止吸潮。 操作步骤：（本操作步骤按照 1mg抗体的量进行标记） 1.取1mg 待标记抗体于超滤管中，并加入不超过超滤管最大体积的标记缓冲液， 12,000 g 离心 10min；可以重复此步骤多次；最后一次超滤完成，可以加入适量标记缓冲液调整抗体的浓度到2mg/mL左右； A.超滤管的最大体积和最大截留分子量，本实例超滤管的最大体积为 0.5mL； B.如果待标记抗体浓度低时，可先超滤离心浓缩； C.如果待标记物含有游离的氨基（Tris,氨基酸或者其他干扰物，需要用标记缓冲液反复超滤确保其去除干净）。 2.加入溶解的FITC 12.5µL至上述超滤管中，并轻轻吹打混匀。放入37℃恒温箱中避光温育 60min以上； 3.标记结束以后加入 1/10体积的FITC清除指示剂至上述超滤管中； 4.12,000g 离心 10min； 5.加入适量标记缓冲液至上述超滤管中，并轻轻吹打混匀，12,000g 离心 10min。并重复操作多次，直至超滤管中没有蓝色，未标记的FITC被彻底清除干净；收集超滤管中的溶液，即为FITC标记抗体。 标记偶联比率的计算:
C是某个蛋白的一个常数； MW是蛋白的分子量； 389是FITC的分子量； 195是偶联的FITC在490nm（PH13.0）情况下1mg/ml的吸光值； (0.35ⅹA495)是FITC在280nm情况下吸光值的校正系数； E0.1%是1.0 mg/ml的蛋白在280nm的吸光值。 |
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