高通量测序的发展现状

NJmerrybio 2020-01-15

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抗体是指机体的获得性免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞经历产生、成熟、增殖、分化并分泌的可与相应抗原发生特异性结合的一类免疫球蛋白。抗体是由两条完全相同的重链和两条完全相同的轻链由二硫键和非共价键结合形成的“Y”形对称结构的复合物。

根据理化性质和生物学功能不同，抗体分为IgG、IgM、IgA、IgD、IgE五类（表1）。

● IgG抗体占血清Ig总量的80%，分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4四个亚类，是机体抗感染的“主力军”。IgG在血清中持续的时间长，半衰期为20~23d，是唯一能在母亲妊娠期穿过胎盘的抗体；

● IgM占血清Ig总量的5%~10%，是免疫应答中最先分泌的抗体，是机体抗感染的“先头部队”，可用于感染的早期诊断；

● IgA抗体占血清Ig总量的10%~15%，分为单体型IgA和分泌型IgA。分泌型IgA主要分布于呼吸、消化、生殖等管道的粘膜表面和乳汁、唾液、泪液中，可中和感染因子，参与局部粘膜免疫，是机体抗感染的“边防军”；

● IgD抗体占血清Ig总量的0.2%，主要出现在成熟的B淋巴细胞表面上，与B细胞的分化相关；

● IgE抗体是血清中含量最少的抗体，约占血清Ig总量的0.003%，主要由粘膜下淋巴组织中的浆细胞分泌，参与超敏反应，与机体抗寄生虫免疫相关。

抗体是B淋巴细胞抗原受体（Bcellantigenreceptor,BCR）的分泌形式，抗体的产生和成熟过程也就是B细胞的产生、发育、增殖和分化的过程。其重链由V、D、J、C四个基因片段编码的，轻链由V、J、C三个基因片段编码。成熟的B细胞从骨髓释放到外周血中，经过特异性抗原的刺激后会进入淋巴结的生发中心，在生发中心中经过细胞增殖、体细胞超突变、亲和力成熟、抗原受体编辑、种型转化等复杂事件，分化成能分泌特异性抗体的浆细胞和少数的记忆性B细胞。经过生发中心的体细胞超突变和亲和力成熟过程，进一步增加了抗体谱（Antibodyrepertoire）的多样性，使抗体的数量达到了1013的天文数字，并提高了抗体对特异性抗原的亲和力。

抗体是获得性免疫的主要组分，在防御性及致病性的免疫反应中起关键的作用。通过对抗体发生、发展和成熟过程的解析，促进了对传染性疾病病理机制、疫苗设计、自免疫疾病治疗等免疫学相关的研究。例如，通过对HIV-1缓慢进展患者体内中和广谱抗体产生及成熟通路的解析，以获得具有高效中和效应的HIV-1特异抗体，并开始应用于HIV-1疫苗的研发。在类风湿性关节炎自免疫疾病中，自身抗体基因IGHV4-34明显富集，可以作为类风湿性关节炎检测的分子标记和免疫治疗的靶点。通过对抗体发生、发展的深入及全面解析，不仅能增加我们对免疫调节的认识，而且为疾病的治疗和疫苗的研发等临床应用提供新的技术与方案，引领新型治疗性抗体研究的时代。

低通量测序在抗体研究中的应用

随着测序技术的发展，抗体组学的研究经历了从低通量到高通量的时代变革。在1990~2000年时，主要利用RT-PCR扩增和Sanger测序技术研究少量B细胞的抗体特征。应用这一技术，人们开展了致病病毒如HIV-1、流感病毒的单克隆抗体和自免疫疾病相关自身抗体的研究。通过抗体测序结合克隆表达，人们获得了第一代HIV-1的广谱抗体如b12、4E10、2G12等抗体，解析了它们的抗原识别位点，为HIV-1疫苗的研发提供了指导。运用这一技术，Wardemann等阐明骨髓中产生自身抗体及多效抗体的B细胞至少经过2步独立的自体耐受性的检测，当这一过程发生异常时会导致产生分泌自身抗体的浆细胞，诱发自身免疫疾病如系统性红斑狼疮和风湿性关节炎。

由于技术的低通量性，每次实验只能分析几十到几百个B细胞的抗体特性，与抗体谱的巨大数据相比，低通量技术只为我们揭示了冰山的一角。

高通量测序在抗体组学中的应用

对免疫系统的认识及对抗体的挖掘及应用需要人们能全面深入的了解抗体谱的整体特征，因通量限制，这个目标是传统技术无法实现的。罗氏454和IlluminaMiseq为代表的下一代测序技术的应用，一次测序即可获得数以百万计的B细胞的抗体可变区域序列。结合分子标记与细胞标记技术，NGS为人们展示了更广阔的抗体谱特性，数据量更加接近人体抗体谱真实数量，使抗体的研究进入了大数据的时代。高通量数据的捕获也使得研究抗体家系及抗体的成熟途径成为现实。以下将从实验的操作、测序平台的选择、数据的分析三个方面详细介绍高通量测序在抗体组学中的进展与应用。