不断发展的DNA 测序技术

抗体因具有高度靶向特异性、亲和力和安全性，已经在许多重大疾病的治疗、诊断和预防中得到广泛应用，是当今新药研发的一个重点。目前获得医用单克隆抗体或抗体片段的基因有多种途径，应用较为广泛的技术包括杂交瘤技术或经重组基因库筛选功能性抗体片段技术，但无论是应用这些体内还是体外的抗体筛选技术，发现一个药用价值的抗体基因都依赖于许多操作步骤，如抗原免疫动物、杂交瘤筛选、重组基因库构建、细胞或无细胞基因展示、基因的功能进化等耗时费力的过程。因此寻求新技术提高医用抗体筛选效率的需求十分迫切。

高通量DNA测序技术为分析抗体基因序列，特别是针对大容量、多样性高的抗体基因库序列的系统分析提供了可能，该技术在抗体领域的应用才刚起步，但已经展示出良好的应用前景。本文就近几年来高通量DNA测序技术在抗体领域中的应用情况进行综述，以期为抗体新药研发寻求一条新的技术思路。

DNA测序技术的发展现状

DNA测序技术经历了3代发展历程:

● 第1代DNA测序技术主要指：Sanger发明的“DNA双脱氧链末端终止测序法”测序技术及同年Maxam和Gilbert建立的“DNA化学降解测序法”。与Sanger测序法比较，Maxam-Gilbert法的突出优点是所测的序列来自原DNA分子而不是酶促合成产生的拷贝产物。

2005年以前，Sanger测序技术作为主要的基因测序工具，对生命科学做出了巨大贡献。目前它仍在PCR产物、质粒、细菌人工染色体的末端检测、基因分型方面发挥重要作用。随着蛋白组学时代的到来，面对大量的DNA信息需要更为高效、高通量、低成本的DNA测序技术，而Sanger测序仪，如目前应用广泛的3730xlDNA测序仪，由于对电泳分离技术的依赖，很难进一步提升分离速度，难以实现微型化反应，因此已经无法大幅度降低测序费用和提高检测通量。

● 以高通量和低成本为特征的第2代DNA测序技术(next-generation sequencing technology)采用一种称为循环芯片测序法(cyclic-array sequencing)的策略，其基本原理就是在DNA芯片上反复进行体外DNA的酶法操作(聚合酶反应或连接酶反应)和图像采集的迭代循环。

目前代表性的第2代高通量DNA测序技术平台主要有454GSFLXsequencer测序仪、Illumina测序仪(或Solexa测序仪)、SOLiD测序仪等。第2代DNA测序技术的不足之处主要体现:

①测序的长度有限，其DNA测序长度在50～400bp，明显短于Sanger技术的测序长度(1000bp)。

②测序的准确率有待提高，其测序技术的准确率要比Sanger测序技术低10倍，主要原因是第2代测序技术依赖于PCR的扩增技术。

● 为了避免由于PCR扩增带来的测序误差，目前科学家们正在开发针对单分子直接检测的第3代DNA测序技术(next-next-generation sequencing technology)，其中最具有代表性的测序仪有HeliScope单分子测序技术、Pacific单分子实时DNA测序技术(single molecule real time DNA sequencing technology)及纳米孔测序技术(nanopore sequencing technology)等。前两者是利用荧光信号进行测序，后者是利用不同碱基产生的电信号进行侧序。目前HeliScope单分子测序仪已经上市。

2009年12月我国中科院北京基因组研究所与浪潮集团成立了“中科院北京基因组研究所—浪潮基因组科学联合实验室”，正致力于研发国产第3代基因测序仪。