中国热带农科院开发新的分子克隆系统！比Gateway克隆有一定优势

DNA分子克隆技术是分子生物学研究中最经常使用的技术之一。半个世纪前出现的酶切-连接克隆技术打开了基因工程研究的大门。但酶切-连接克隆受酶切位点的限制，并且操作比较繁琐。因此，不依赖酶切位点的基因重组技术Gateway克隆受到了众多实验室的欢迎，被广泛用于各类载体构建。但是Gateway克隆也存在几个缺点：1. 不能直接使用PCR产物，需要先构建入门克隆。2. 不能无缝克隆，留下至少25bp的疤痕（scar）序列。3. 不易进行多片段克隆。4. 试剂盒价格昂贵。

为解决Gateway克隆的缺点，中国热带农业科学院热带生物技术研究所的言普副研究员等人开发了一种新型的标准化分子克隆技术──Nimble Cloning。该系统目标载体的克隆位点处设计有通用接头-SfiI-ccdB-SfiI-通用接头的结构，带有20 bp通用接头序列的目标DNA直接与环状目标载体混合，在SfiI限制性内切酶和T5核酸外切酶混合反应液作用下完成克隆。其克隆反应原理为：由SfiI切开环状载体，T5核酸外切酶在线性DNA两端沿5＇- 3＇方向进行消化，目标基因和载体两端由于设计有重叠序列，消化后露出的互补DNA单链能够结合，转化大肠杆菌后即可获得重组克隆。

Nimble Cloning技术原理示意图

Nimble Cloning较好地解决的Gateway克隆的缺点：1. Nimble Cloning 既可使用PCR产物，也可使用入门克隆。2. Nimble Cloning既可使用通用接头进行标准化克隆，也可进行无缝克隆。3. Nimble Cloning可方便地进行多片段克隆。4. Nimble Cloning为国产分子克隆系统，价格只有Gateway克隆的1/10。

为了方便Nimble Cloning技术的推广使用，言普等还开发了一系列配套的pNC系统表达载体，包括原核表达、酵母双杂交、植物超过表达、植物RNAi、植物亚细胞定位、植物BiFC、植物基因编辑、植物VIGS、哺乳动物表达载体等，初步形成了一个标准化的克隆系统，为基因功能研究提供了一个便利的平台。该套载体向科研人员开放共享，可免费索取使用（Email: [e-mail], QQ: 328995517）。

Nimble Cloning系统表达载体

该技术近期以 “Nimble Cloning: A Simple, Versatile, and Efficient System for Standardized Molecular Cloning” 为题发表在国际期刊Frontiers in Bioengineering and Biotechnology。该技术在发表论文前，已在十多家科研单位使用，取得了良好的使用效果，有望成为分子克隆领域的标准系统。