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微生物实验 基础操作及 常见问题 答疑（一） 2月23日下午14：00-15：00，来自杭州绿城检测的王珍老师，通过食品伙伴网平台为广大网友们带来了一场精彩的“微生物实验基础操作及常见问题解析”网络公开课，听课的网友们热情高涨，大家都表示受益匪浅。课后，王老师对于课程中小伙伴提出的一些疑问进行解答，并交由小编为大家整理汇总，由于问题较多，我们将分三部分发送。今天小编与大家分享第一部分。 1、微生物实验室环境监控哪些项目？ 微生物洁净室需要进行环境监控。项目有温度、相对湿度、风速、换气次数、静压差、悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面微生物。洁净室的年度监测一般由有资质的机构进行。依据：GB/T 27405-2008 实验室质量控制规范食品微生物检测5.2.2 附录C.3和 《检验检测机构资质认定能力评价 检验检测机构通用要求》(RB/T 214-2017)：4.3.3。GB 50591《洁净室施工及验收规范》 2、无菌室温湿度要求多少？ GB/T27405-2008实验室质量控制规范 食品微生物检测附录B 1.6无菌室推荐温度为20℃,相对湿度为40%-60%。 3、培养皿放进培养箱培养到底怎么放？ 细菌培养：倒放。倒置的平板不仅使杂菌不易沉降到培养基表面并且琼脂水分不易蒸发保持细菌容易繁殖和生存的环境，同时也避免平皿盖上的水蒸汽冷凝后回滴到琼脂表面导致菌落蔓延。 霉菌培养：正放。避免霉菌在反复观察的过程中因上下颠倒平板导致霉菌孢子散落形成次生小菌落，造成计数结果不准确。 4、负压用什么样的压差表呢？ 洁净室常用的微压差表均可，有嵌入式和悬挂式，安装在洁净室墙体外部，比如下图产品量程为0-60Pa的微压差计，安装时通过调整连接内外室的小导管安装方向，读取正压还是负压的结果，仪表无区别。
5、霉菌培养需要单独的培养室吗？湿度有要求吗？ 目前没有硬性规定，如果当评审专家问你如何避免霉菌培养不影响其它检验结果时，能说出几条有效措施，就可以不单独设置。如果不能，建议单独设置霉菌培养室。 霉菌培养湿度目前GB 4789.15-2016没有明确要求湿度。建议RH 60~85%。参考依据是根据霉菌生长的特点当水活度（Aw）在0.7以下，低于RH30%时，霉菌的繁殖会受到抑制。环境大于RH60%霉菌即可生长，大多数霉菌在相对湿度高于80%时极易生长，因此建议的控制RH 60~85%，过高易造成菌落蔓延。有些霉菌培养箱不具备湿度调节功能，按美国公共卫生协会要求培养48小时琼脂失水不超过15%评价可能涉及理化实验。因此，除肉眼观察平板是否干裂外，建议通过方法验证，用实验数据确认所设的霉菌培养箱在某个湿度下，挑战菌回收率符合要求。 6、没有霉菌培养室的怎么弥补？ 按照GB 4789.1-2016 食品微生物学检验 总则2.2.1实验室环境不应影响检验结果的准确性 的规定需要实验室自行确定是否有影响，针对每一条影响因素比如空气流向、物品转移、计数方式、消毒方式、人员操作技术等，提出预防措施。 7、 霉菌室应有哪些设备？霉菌计数有环境要求吗？ 霉菌培养室一般放置霉菌培养箱、生物安全柜、显微镜等。霉菌计数环境符合一级实验室环境要求即可，霉菌计数是个短暂的过程，只要不打开平皿，一般的环境条件不会对计数结果产生影响，但是要考虑霉菌孢子对环境的污染，计数时最好在生物安全柜里进行。 8、霉菌的培养必须用恒温恒湿培养箱吗？ 非必须，但推荐恒温恒湿培养箱。部份霉菌培养箱比生化培养箱多了紫外消毒功能，无湿度调节功能，也可以用。 9、无菌室保持正压还是负压？ 正压 10 、菌株冰箱放二级生物安全实验室内行吗 ？ 可以，只要做到双人双锁，做到菌株安全保管。 11、无菌间的洁净度级别怎么要求？ 万级背景+局部百级 12、霉菌有单独培养，但是做霉菌的时候是和菌落大肠一起做，可以吗？做霉菌鉴定需要单独房间吗？ 可以。预知霉菌污染严重的样品检测或霉菌鉴定必须在生物安全柜中进行，不一定非要单独一间房。 13、菌落总数，大肠菌群时低稀倍数没有长，越稀释长的菌越多，怎么能避免？ 要视产品类别，如果是酸性产品，可以对样品进行pH调节至中性；如果是含防腐剂的产品，需要了解防腐剂类别在前处理过程中进行中和，中和方法下表供参考。  14、平时是怎么灭活的呢 ? 讲课时未特地描述，实际在清洗间里有灭活专区，放置内循环式高压灭菌器，121℃，30min进行灭活。 15、培养废弃物的处理 ? 实验室需建立废物处置作业指导书。其中把培养废弃物包括进去。主要分固体和液体。原则是无论是否有微生物生长，为安全起见都需消毒或灭菌。浸泡消毒可用0.5％过氧乙酸或有效氯为0.5%的含氯消毒剂，高压灭菌采用121℃ 30分钟，然后由有资质的专业生物垃圾处理公司进行收集处置。 16、我们有个螨的检测项目用到显微镜，要单独一间屋子吗？我们在显微镜室做的，和食品的PH 染色镜检没有分开。 不需要单独一间屋子 17 、百级超净工作台，如何清洁处理 ？ 超净工作台，一般外部的工作台面用防静电无尘布擦拭即可。工作台面的清洁可以用酒精棉、无菌纱布、或防静电无尘布浸泡消毒液进行擦拭。超净台进风口在正面或背面的下方，金属网罩内有泡沫塑料片或无纺布，用来阻拦大颗粒尘埃，也要定期检查、拆洗清洁干净再安装归位。 18 、像第三方这种实验室，比如做饲料类，食品类产品都有，这样实验室怎么布置，是否需要特殊准备饲料实验室？ 食品和饲料应分开，防止交叉污染。分开方式根据实验室的硬件条件，可采取空间分开与时间分开两种。 19、乳品致病菌检验时，如果沙门、阪崎检出了，还是有必要继续做生化鉴定吗？审核老师对我们自己做的生化鉴定结果认可吗？ 致病菌检出按照现有的国标传统的方法都需要生化鉴定（快检除外）。如果你们有该方法的资质或如果是企业按照企业标准操作，审核老师没有理由不认可你们的鉴定结果。可能你们需要关注审核老师可能会重点审查检出致病菌时，样品是如何处置的。 20、方法要求培养温度是36加减1℃，培养箱检定时36实测35.5，这种情况下温度设定时这个检定因子需要考虑吗？也就是有必要设定36.5℃吗？ 培养箱多采取校准。本例中检定因子描述欠妥，36℃的校准修正值为0.5℃，虽然在±1℃之内，但现场评审建议将该修正值加以应用，应用有两种方式：设定时应用，读数时应用。 21、无菌磷酸盐缓冲液保质期多久？ 3～6月。依据：GB 4789.28-2013 食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求3.2.4规定实验室自制培养基，在保证其成分不会改变条件下保存，即避光、干燥保存，必要时在5 ℃±3 ℃冰箱中保存，通常建议平板不超过2周～4周，瓶装及试管装培养基不超过3个月～6个月，除非某些标准或实验结果表明保质期比上述的更长。磷酸盐缓冲液属于悬浮培养基，灭菌后室温、避光保存3-6个月。实验室可从严管理按3个月保存。 22、大肠菌群MPN/100Ml与个/ L关系？ 这两个单位属于不同的方法检测结果，没有换算关系。MPN/100mL表示每100mL中含有大肠菌群的最可能数，个/L 的意思是说每L含有的大肠菌群的个数，菌落的个数和CFU相当，并不与MPN有换算关系。     |
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