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作者：宁雅婷，侯欣，陆旻雅，吴宪，李永哲，徐英春 单位：中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院检验科 通信作者：徐英春 摘要 新型冠状病毒肺炎疫情发展迅速，早期诊断成为疫情防控的关键。2019新型冠状病毒（2019 novel coronavirus，2019-nCoV）核酸检测阳性虽是疑似患者确诊的“金标准”，但其操作繁琐、耗时长，检测结果受抗本质量、病毒感染部位及表达量等众多因素影响，因而核酸单项检测不能满足疫情期间对疑似病例快速筛查的要求。血清特异性抗体是诊断病毒感染的另一关键证据，抗体检测可协同核酸检测用于辅助诊断和快速筛查。本文从抗体产生特点、检测方法及灵敏度/特异度、检测结果假阴性/假阳性及核酸与抗体联合检测等方面进行讨论，以期推动2019-nCoV 血清抗体检测技术的建立与应用。 新型冠状病毒肺炎（coronavirus disease 19，COVID-19）是由2019新型冠状病毒（2019 novel coronavirus，2019-nCoV）感染引起的以肺部病变为主的新发传染病，可引起消化系统和神经系统的损伤，严重者可导致死亡。2019年12月以来，疫情进展迅速，截至2020年2月26日24时，我国累计报告确诊病例78 497例，死亡病例2 744例，全球疫情亦趋于严峻。目前暂无针对2019-nCoV的有效治疗药物，疫苗也处于临床试验阶段，早期诊断、及时收治患者对有效控制疫情至关重要。 《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第六版）》推荐，实时荧光RT-PCR检测2019-nCoV核酸阳性是疑似病例确诊的诊断条件之一。但该技术对实验场所人员要求高、操作繁琐、耗时长，检测人员感染风险高，结果受标本质量、病毒感染部位及表达量等因素影响较大，核酸单项检测并不能满足排查诊断的要求。作为机体免疫系统抵抗病毒的重要效应分子，血清特异性抗体是诊断感染的另一关键证据。抗体检测的操作简单便捷，对实验环境及人员要求不甚苛刻，仅需采集血液标本，很大程度上降低医护人员在标本采集和检测过程中被感染的风险，是快速筛查和核酸辅助诊断的重要手段。 1.抗体产生特点 2.抗体血清学检测方法 目前临床中常用的抗体血清学检测方法有3种。 酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是将抗原或抗体包被在固相载体表面，利用酶标记的抗体或抗原结合待检物，并根据酶催化底物产生的有色产物颜色深浅及有无进行分析的一种定性或半定量检测方法。该检测方法灵敏度较高，载体标准化难度较低，但检测速度慢、易污染、步骤较为繁琐。 化学发光免疫分析法是将高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、抗体、激素等检测。该法灵敏度高于ELISA，具有特异性高、线性范围宽、结果稳定、操作简化等特点，广泛应用于临床标本的检测。 胶体金免疫层析法（colloidal gold immunochromtographic assay，GICA）是以胶体金为示踪标志物，应用于抗原抗体检测的一种新型免疫标记技术，无需特殊处理标本，仅需一滴血即可在15 min内通过肉眼观察获取检测结果。该方法突破了现有检测技术对人员、场所的限制，缩短检测时间，操作方便快速，在基层医疗单位及现场检测中广泛使用。 3.抗体检测灵敏度和特异度 灵敏度反映诊断试验检出感染者的能力，若过低，会出现较多假阴性结果，患者就诊延误，影响疾病干预和预后，严重可导致患者过早死亡；特异度衡量诊断试验能否正确判断非感染者的能力，若过低，出现较多假阳性结果，会浪费医疗资源，并造成患者及群众的焦虑和恐慌。因此，具有较高的灵敏度和特异度是抗体检测试剂的应用基础。 抗体检测的灵敏度主要取决于： 抗体检测的特异性主要与抗原位点的选择有关，目前核衣壳(nucleocapsid，N）蛋白是2019-nCoV检测的主要抗原位点。2019-nCoV属于β冠状病毒属B谱系，在系统发育上与蝙蝠SARS样冠状病毒（bat-SL-CoVZC45)最为接近。N蛋白在β属冠状病毒之间相对比较保守，合成数量众多，具有很强的抗原性，在诱导宿主免疫应答甚至发病机制中发挥重要作用，常用作冠状病毒诊断的抗原位点。 4.抗体检测假阴性及假阳性结果分析 假阳性和假阴性结果会影响临床诊断。为提高2019-nCoV抗体检测的准确性，有必要对可能出现的及原因进行深入分析。 （1）防腐剂和抗凝剂：采用防腐剂叠氮化钠、抗凝剂EDTA等处理标本，会抑制辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）的活性，造成ELISA假阴性。 （2）标本保存不当：当标本在冰箱中保存过久时，血清中IgG聚合成多聚体，且抗体免疫活性减弱。 （3）实验员操作失误或试剂盒保存不当：试剂使用前未平衡至室温，试剂用量不足，温育时间或温度不足；试剂未按规定保存，受到污染或失效等。 （4）层析过快：抗原抗体复合物尚未与检测线上的抗体结合，就越出检测线，造成GICA假阴性。 4.2 抗体检测假阳性 (1) 溶血或红细胞标本：红细胞的细胞内液中各种酶可与底物发生非特异性反应，且血红蛋白中亚铁血红素与HRP活性类似，可催化底物，造成ELISA检测假阳性；检测区堆积形成颜色较浅的非特异性条带，干扰目视法判定胶体金试纸结果。 (2) 纤维蛋白的影响：由于标本凝集不全或离心转速过低、时间太短，血清中的纤维蛋白未完全析出，形成的块状或絮状物堵塞洗板机头。 (3) 细菌污染标本：菌体内可能含有内源性HRP，造成ELISA假阳性结果；此外，疏水性的菌体碎片与金标粒子或捕捉抗体发生结合，影响GICA判读。 (4) 患者自身原因：体内存在自身抗体、嗜异性抗体等，如患有某些基础疾病或免疫功能异常，或长期服用某种药物，可产生异常蛋白抗体或特殊物质，如类风湿因子、甲胎蛋白、补体等，具有一定吸附作用，造成抗体检测假阳性。 5.核酸与抗体联合检测结果解读 核酸与抗体联合检测可提高检测效率，当联合检测结果出现以下情况时，需要综合分析判断进行结果的解读。 5.1 核酸检测阳性时，抗体检测出现阴性或阳性结果 (1) 核酸阳性，IgM和IgG均为阴性 患者可能处于2019-nCoV感染“窗口期”：“窗口期”是指从人体感染病毒后到外周血中能够检测出病毒抗体的这段时间，一般为２周。这段时间内，无法检测血液中的病毒抗体，因此，IgM和IgG均为阴性。此时处于感染早期，病毒不断复制，核酸载量呈指数递增，达到核酸检测下限，核酸检测呈阳性。核酸检测较血清抗体检测的优势在于缩短了感染检出窗口期，可及早发现感染者。 (2) 核酸阳性，IgM阳性、IgG阴性 (3) 核酸阳性，IgM阴性、IgG阳性 (4) 核酸阳性，IgM阳性、IgG阳性 5.2 核酸检测阴性时，抗体检测出现阴性或阳性结果 (1) 核酸阴性，IgM阳性、IgG阴性 IgM阳性提示极大可能处于2019-nCoV感染急性期，此时需考虑核酸检测结果存疑。出现核酸检测假阴性的原因及应对建议主要有以下几方面：标本质量差：采集上呼吸道的口、鼻咽拭子等部位标本时，推荐采集鼻咽拭子进行病毒核酸检测，为了提高检测阳性率，建议采集同一患者多部位标本（口咽拭子、鼻咽拭子、鼻腔拭子等）合并检测；对于有消化道症状的疑似患者，可同时采集粪便或肛拭子进行检测。标本采集保存不当：没有正确保存、运输和处理标本。推荐4°C运送标本（因RNA易降解）。技术本身原因：如病毒变异、PCR抑制等。由于2019-nCoV为单股正链RNA病毒，分子量大，具有易变异的特性，传播过程中可能会产生核酸序列的变异，若处于核酸扩增的引物结合区，就会出现假阴性结果。建议针对多个核酸区域进行扩增，可有效避免核酸变异对检测结果的影响。因此，当核酸检测结果为阴性时，只可报告本次检测结果阴性，不可排除2019-nCoV感染，需多次重复确认。患者有其他疾病，已发现类风湿因子引起IgM弱阳性或阳性的病例。 (2) 核酸阴性，IgM阴性、IgG阳性 (3) 核酸阴性，IgM弱阳性、IgG阴性 (4) 核酸阴性，IgM阳性、IgG阳性 6.结语 综上所述，相关医疗机构应尽早建立2019-nCoV血清抗体检测技术。抗体检测可用于2019-nCoV核酸检测阴性疑似病例的补充检测或在疑似病例确诊时与核酸检测协同应用。在COVID-19的不同疾病进程中，核酸和抗体检测的效率不尽相同，两者协同使用，可取长补短，提高诊断效率，监测疾病进展。而正确解读联合检测结果，可提高2019-nCoV的快速诊断和鉴别诊断能力，更好地了解病毒载量和疾病进展，指导临床诊疗工作。 来源：协和医学杂志 DOI: 10.3969/j.issn.1674-9081.20200050 |
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