Cancer Letters|胰腺癌：蛋白组转录组

生物_医药_科研 2020-03-26

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Novel targets identified by integrated cancer-stromal interactome analysis of pancreatic adenocarcinoma

癌-基质相互作用组分析确定的胰腺癌新靶标

首先让我们通过摘要了解一下这篇文章的主要内容，胰腺癌微环境对癌症的发展，进展和耐药性至关重要并且癌症-基质相互作用已被认为是癌症治疗的重要靶标。但是目前缺乏分析整个癌症-基质相互作用基因组的定量方法，因此鉴定相关的和可治疗的癌症-基质相互作用是具有挑战性的。在这里，作者研究了14例切除的胰腺癌标本（癌症组为8例胰腺癌（PDAC）患者对照组为6例导管内乳头状粘液腺瘤（IPMA）患者）。作者采用激光捕获显微切割技术（LCM）对胰腺癌间质病变进行了蛋白组学研究，共鉴定出102种差异表达蛋白。接下来作者从TCGA数据库（n=169）和GTEx数据库（n=197）中获得了人胰腺癌和正常胰腺组织中的基因表达数据，并鉴定了1435个在胰腺癌细胞中差异表达的基因。为了确定相关的和可治疗的癌症-基质相互作用靶标，作者将这些数据集应用到内部配体-受体数据库中。最后作者确定了PDAC患者的9个关键基因和8个关键癌症-基质相互作用靶标。此外，作者使用271例PDAC患者的TMA检查了胰腺癌组织中FN1和ITGA3蛋白的表达，并证明FN1-ITGA3对PDAC患者的预后有不利影响。

一.材料和方法

1.1蛋白组学分析和免疫组化的病人选择

该研究人群包括14例胰腺肿瘤患者（表1），他们在横滨市立大学胃肠病外科进行了原发性胰腺病变切除术以进行蛋白质组分析，还有在神奈川癌症免疫组织化学中心胃肠外科接受原发性胰腺病变切除术的271例PDAC患者。

表1. 蛋白质组学分析的样本总结

1.2冷冻组织切片的准备，LCM的染色和脱水，基质组织LCM以及蛋白质提取

这一部分主要是实验，作者将来自胰腺肿瘤患者的组织切成切片，进行苏木精和H＆E染色后，其中苏木精染色用于指导乙醇脱水切片中的LCM。染色之后用PBS洗涤并脱水。然后作者在明亮的地方对LCM样品切片进行了可视化，可以在组织中识别出胰腺癌，腺瘤和正常导管（图1A），并在组织中识别出了胰腺腺泡细胞和胰岛。H&E染色参考切片的扫描被用来绘制胰腺间质区（图1B）。从胰腺组织切片上显微解剖胰腺癌，腺瘤，正常导管，腺泡细胞和胰岛，其余组织定义为胰腺间质。接下来将LCM组织收集起来，最后应用一些实验试剂在LCM样品中提取蛋白质。

图1. 苏木精染色的胰腺癌切片的代表性图像

1.3基因表达数据

作者分别从TCGA和GTEx数据库中获得胰腺导管腺癌和正常胰腺组织的基因表达数据集。还从ReCount2数据库中获得了基因表达数据集SRP038143，其中包含三个常见胰腺细胞系（MIA PaCa2，PANC1，HPAC）的完整转录组测序数据。

1.4差异表达蛋白质和基因的数据处理与筛选

使用Empirical Bayes方法基于EdgeR软件包在PDAC和IPMA（或正常胰腺）样品之间鉴定出重要的DE蛋白（或基因），并应用FDR方法，对P值进行多次矫正。

1.5 DE蛋白和基因的通路富集分析

作者利用Metascape对DEGs进行了功能注释和通路富集分析，主要来源于KEGG，GO-BP，Reactome Gene Sets，Canonical Pathways和CORUM。

1.6内部配体受体数据库的构建

作者已经建立了一个内部的配体-受体数据库。该数据库的构建包括三个主要步骤（i）从人蛋白质参考数据库（HPRD）中提取定位信息（ii）从KEGG数据中提取配体-受体相互作用（iii）通过回顾原始文献进行整理。首先，分别选择主要定位于细胞外空间和质膜的蛋白质作为配体和受体候选物。从人类蛋白质参考数据库（HPRD）下载了主要定位信息。在所有配对配体和受体候选物中，只选择那些出现在KEGG通路数据库中的蛋白质-蛋白质相互作用中的配对，进入下一步处理步骤。相互作用的方向是根据KEGG数据库中的11种关系（激活，抑制，结合/缔合或间接作用）确定的。

1.7 PDAC中关键基因的Kaplan-Meier生存分析

为了评估候选基因的预后价值，根据基因的中位表达值将患者样本分为两组。从TCGA获得临床信息，并使用R中的survival包通过Kaplan-Meier方法进行生存分析。应用对数秩检验评估显著性。

1.8免疫组化和计分程序

首先从相同的肿瘤区域采样两个直径为1.5毫米的核心区域构建组织微阵列（TMA）。从每个TMA块切下四微米的切片，并使用抗FN1的抗体进行手动免疫组织化学。来自多个组织块的切片用作阳性和阴性对照。用自动扫描系统以20倍的放大倍数扫描载玻片。基质中FN1染色的强度和癌细胞中ITGA3染色的强度评分为：0级，未染色；1级，微弱染色；2级，弱染；和3级，严重染色。由两名观察员确认免疫组化评估，作者将0级和1级定义为阴性，而将2级和3级定义为阳性进行统计分析。

1.9统计分析

使用R语言中的TCC包和ggplot2包对DE 基因进行无监督聚类，绘制MA图和热图。还应用R语言进行了主成分分析。使用Mann-Whitney U检验或Fisher精确检验进行FN1 / ITGA3染色和临床病理学变量分析。通过单变量和多变量分析评估了OS和目标变量之间的关系。使用Kaplan-Meier方法计算OS曲线，并通过对数秩检验进行比较。Cox的比例风险模型用于进行单变量和多变量生存分析。

二.结果展示

2.1 PDAC患者胰腺基质中的DE蛋白

作者应用shotgun LC–MS/MS,测量了肽段，然后使用蛋白质组学软件Progenesis QI进行了相对定量分析，以确定PDAC和IPMA组之间蛋白质组成的差异。在这些样品中共检测到5237个源自1017个蛋白的肽。PDAC和IPMA基质组织中蛋白质表达水平的树状图显示，PDAC和IPMA样品清楚地分为2个簇（图2A）。作者在两组样品中筛选出138个DE蛋白。DE蛋白被转化为95个基因符号（图1C）。

图2. PDAC基质中差异表达蛋白的鉴定和通路富集分析

2.2 PDAC基质中DE蛋白的通路富集分析

DE蛋白共富集到14个功能terms，作者选择了显著富集的terms的子集并将其呈现为网络图，其中相似性> 0.3的terms通过边连接，并根据p值选择具有代表性富集项的前20个簇（图2C）。

2.3使用公共数据库识别PDAC细胞中的DEGs

为了探索PDAC组织与正常胰腺组织之间基因表达的差异，从公共数据库（TCGA和GTEx）中获取PDAC和正常胰腺组织的基因表达数据集。主成分分析的结果可以直接将PDAC组织与正常组织区分开（图3A）。与正常组织相比，在PDAC组织中总共鉴定出4131个DEGs。之后，作者滤除了三种常见胰腺癌细胞系（SRP038143）的基因表达数据集中未检测到的基因，将1434个基因（包括1240个上调基因和194个下调基因）鉴定为PDAC细胞中的DEG（图1C，3B）。

图3.PDAC细胞中差异表达基因的鉴定和通路富集分析

2.4过滤后DEGs的层次聚类图及通路富集分析

作者对筛选出的1434个DEG展示为分层聚类图（图3C），并对这些DEG进行了通路富集分析。图3D显示了显著富集的terms的前20个簇。其中包括12个显著富集的GO-BP terms，结合PDAC基质中富集的GO-BP terms和DE蛋白通路，仅有3个GO-BP terms重叠，包括细胞外基质组织、损伤反应和肌动蛋白细胞骨架组织。这些结果表明，这3个GO-BP terms中包含的某些基因可能是胰腺癌中细胞-基质相互作用的关键基因。

2.5使用多个平台的集成交互组分析

在这一部分作者使用PDAC组织的间质区域鉴定了PDAC基质中的138个DE蛋白，为了跨多个平台整合这些数据，将138个DE蛋白转换为95个DE基因（DEG）。之后，将PDAC基质中的95个DEG和PDAC细胞中的1434个DEG列表整合到内部的配体-受体相互作用数据库中。在配体-受体相互作用中寻找信号转导的两个方向，即从癌症配体到基质受体以及从基质配体到癌症受体。最后确定了8种关键的癌症-基质相互作用（表2）。

2.6 Kaplan–Meier生存分析

为了分析8个关键相互作用的预后相关性，使用R中的survival包进行了Kaplan -Meier分析，按相互作用相关基因的中值表达值进行分组。结果显示FN1和ITGA3与OS呈负相关（图4）。

图4. 通过Kaplan-Meier绘图仪对9个候选基因的总体生存分析

此外，按与8种关键相互作用相关的基因的共表达值进行分层的Kaplan-Meier分析表明，FN1-ITGA3相互作用和FN1-ITGA5相互作用是PDAC患者预后的不利因素（图5）。

图5. Kaplan-Meier绘图仪对八种候选相互作用的总体生存分析

2.7免疫组化

图6显示了FN1，ITGA3和ITGA5染色的胰腺癌组织的代表性图像。作者检测到基质细胞（特别是成纤维细胞）中FN1蛋白表达增加，癌细胞中ITGA3蛋白表达增加，而癌细胞中基质细胞中未检测到ITGA5蛋白表达增加（图6）。该结果表明，ITGA5作为胰腺癌细胞中FN1的受体可能没有发挥重要作用。

图6. FN1，ITGA3和ITGA5染色的胰腺癌组织的代表性图像

接下来，作者使用271位胰腺癌患者的TMA检查了胰腺癌组织中的FN1和ITGA3蛋白表达。在271例胰腺癌病例中，作者检测到178例（65.7％）的基质细胞中FN1蛋白表达增加，而90例（33.2％）的癌细胞中的ITGA3表达增加。作者统计了FN1 / ITGA3共表达与其他临床病理参数的关联，发现FN1 / ITGA3共表达仅与复发率显著相关，而与其他参数无显著相关性。最后作者估计了271例患者的OS，结果显示FN1阳性组，ITGA3阳性组和FN1 / ITGA3阳性组显示出明显较差的存活率（图7）。OS的预后因素在表4中显示。