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大家好，今天为大家带来Cancer Letters中的一篇文献。
研究背景： 胰腺癌是一种预后极差的恶性肿瘤,近年来其发病率和死亡率持续上升。目前临床上应用的化疗药物吉西他滨和FOLFIRINOX的疗效非常有限,免疫检查点抑制剂也仅对少数胰腺癌患者有效。肿瘤微环境被认为是导致胰腺癌对治疗耐药的重要因素之一。 肿瘤相关巨噬细胞是胰腺癌肿瘤微环境中的主要组成部分,可以促进肿瘤的生长、血管生成、免疫抑制等,但导致巨噬细胞功能改变的关键因素还不明确。TGFBI是一种细胞外基质蛋白,在不同肿瘤中的作用机制还不明确。本研究利用单细胞RNA测序技术分析了小鼠胰腺癌模型中的各种细胞,发现肿瘤相关巨噬细胞高表达TGFBI。进一步研究发现TGFBI可以调控巨噬细胞的分化和功能,并作为分泌因子影响肿瘤细胞增殖。 本研究建立了TGFBI基因敲除小鼠模型,通过条件性基因敲除的方式特异性抑制巨噬细胞中的TGFBI表达,观察其对胰腺癌生长的影响。结果表明抑制巨噬细胞TGFBI表达可以抑制肿瘤生长、改善免疫微环境。这为开发以调控巨噬细胞功能为目标的胰腺癌治疗提供了理论基础。 综上所述,本文通过多种小鼠胰腺癌模型、单细胞测序等技术手段系统阐明了TGFBI在胰腺癌发生发展中的作用,为开发靶向TGFBI的胰腺癌治疗提供了理论依据和实验平台。 研究概要： 1. 利用单细胞RNA测序技术发现,在小鼠胰腺癌模型中,肿瘤相关巨噬细胞是表达TGFBI最高的细胞类型。免疫组化结果也显示人胰腺癌样本中TGFBI主要由肿瘤相关巨噬细胞表达。 2. TGFBI的表达水平与人胰腺癌细胞的增殖标志物Ki67呈正相关。敲低巨噬细胞TGFBI表达能抑制胰腺癌细胞增殖。 3. TGFBI参与调控巨噬细胞的分化和功能。敲低TGFBI表达影响巨噬细胞的M2型极化,并改变其分泌细胞因子的模式。 4. TGFBI敲低的巨噬细胞能抑制T细胞的增殖和活化,增加PD-1表达。添加重组TGFBI蛋白可逆转这一效应。 5. 在小鼠模型中,敲低巨噬细胞TGFBI表达能抑制胰腺癌的生长,并改善肿瘤微环境。 6. 在TGFBI基因敲除小鼠模型中,特异性敲低巨噬细胞TGFBI表达同样抑制了肿瘤生长。 7. 敲低巨噬细胞TGFBI表达增强了吉西他滨化疗的疗效。 8. TGFBI至少部分通过调控纤维连接蛋白等细胞外基质蛋白发挥作用。 综上,本文证明TGFBI是调控巨噬细胞功能的关键因子,并且可以作为治疗靶点,联合化疗改善胰腺癌的预后。这为开发新型的胰腺癌免疫治疗提供了理论基础。 研究内容： 1利用单细胞RNA测序技术,研究者发现在小鼠胰腺癌模型中,肿瘤相关巨噬细胞是表达TGFBI最高的细胞类型。 研究者首先建立了两种不同的小鼠胰腺癌模型,分别以Panc02细胞和Panc02-H7细胞进行正位移植,获得原发性胰腺癌。然后利用单细胞RNA测序技术分析了这两种肿瘤中的活细胞转录组。单细胞RNA测序可以解析肿瘤组织中的不同细胞亚群及其基因表达谱。研究者应用无监督聚类和t分布随机近邻嵌入(t-SNE)分析了两种肿瘤中不同细胞亚群的相对丰度。结果发现,在两种肿瘤中肿瘤相关巨噬细胞的比例最高,且巨噬细胞群体中TGFBI的表达水平远高于其他细胞类型。这说明肿瘤相关巨噬细胞是表达TGFBI最主要的细胞。 为进一步验证这一发现,研究者分别从小鼠肿瘤组织中分离出F4/80阳性的肿瘤相关巨噬细胞和其他非巨噬细胞,检测其TGFBI mRNA水平。结果显示巨噬细胞中的TGFBI mRNA表达量是其他细胞的13倍。然后通过免疫印迹检测了不同来源巨噬细胞中的TGFBI蛋白水平,包括肿瘤相关巨噬细胞、腹腔巨噬细胞和体外诱导的骨髓来源巨噬细胞。结果表明肿瘤相关巨噬细胞中TGFBI蛋白表达最高。最后,研究者通过抗CSF1R抗体清除小鼠体内巨噬细胞,发现抗体处理后肿瘤组织中的TGFBI明显下降。 综合单细胞RNA测序、免疫组化和Western blot结果,研究者证实在小鼠胰腺癌模型中,肿瘤相关巨噬细胞是表达TGFBI最主要的细胞类型。
2人类胰腺癌样本中肿瘤相关巨噬细胞也高表达TGFBI。 在小鼠模型中发现肿瘤相关巨噬细胞高表达TGFBI后,研究者进一步在人类胰腺癌样本中验证了这一发现。首先通过免疫荧光染色,研究者观察到CD206(标记M2型巨噬细胞)与TGFBI在人胰腺癌组织切片中高度重合表达。这表明TGFBI确实主要由肿瘤相关巨噬细胞表达。免疫组化结果也显示,与正常胰腺组织相比,TGFBI在人原发性和转移性胰腺癌组织中的表达明显增高,提示TGFBI可能与胰腺癌的生长和转移相关。 然后研究者检测了人胰腺癌样本中TGFBI和增殖标志物Ki67的表达,发现二者呈正相关。Ki67主要在肿瘤细胞中表达,提示TGFBI可能促进肿瘤细胞增殖。此外,研究者还检测了血管生成标志物,发现TGFBI仅与Ki67呈正相关,而与血管生成标志物不相关,这进一步支持TGFBI促进胰腺癌细胞增殖的结论。 综上,通过免疫荧光和免疫组化等多种技术手段,研究者证实TGFBI在人胰腺癌中也主要由肿瘤相关巨噬细胞表达,且TGFBI的表达与肿瘤增殖正相关。
3使用siRNA敲低巨噬细胞中的TGFBI表达,发现TGFBI参与调节巨噬细胞的分化和功能。 在确认TGFBI主要由肿瘤相关巨噬细胞表达后,研究者采用siRNA的方式在体外敲低骨髓来源巨噬细胞中的TGFBI表达,观察其对巨噬细胞分化和功能的影响。首先,研究者用M-CSF诱导小鼠骨髓细胞分化为巨噬细胞,然后转染TGFBI siRNA敲低TGFBI的表达。随后加入IL-4和TGF-β促进巨噬细胞向M2型极化。结果发现,与对照siRNA相比,敲低TGFBI的巨噬细胞中一些M2相关基因(如Arg1、CCL2等)的表达下降,而M1相关基因(如TGF-β)的表达上升。流式结果也显示,敲低TGFBI后巨噬细胞分化为CD206阳性的M2型细胞的比例降低。这表明TGFBI参与调控巨噬细胞向M2型极化的过程。 然后研究者检测了敲低TGFBI对巨噬细胞调节T细胞功能的影响。将敲低TGFBI的巨噬细胞与脾脏T细胞共培养后,发现与对照相比,这些巨噬细胞能促进T细胞的增殖和活化,并抑制T细胞PD-1表达。添加重组TGFBI蛋白可阻断这些效应。这说明TGFBI也参与巨噬细胞调节T细胞功能。 综上,通过siRNA敲低TGFBI的方式,研究者证明TGFBI可以作为巨噬细胞的内源性因子,参与调控巨噬细胞的分化和功能,特别是向M2型极化以及调节T细胞的过程。
4敲低TGFBI表达的巨噬细胞可以抑制胰腺癌细胞的体外增殖。 既然TGFBI可以调控巨噬细胞的功能,研究者进一步检测敲低TGFBI是否可以改变巨噬细胞促进肿瘤生长的作用。首先,他们用siRNA敲低了巨噬细胞中的TGFBI表达,然后将这些巨噬细胞与CFSE标记的胰腺癌Kras细胞共培养,检测不同比例下肿瘤细胞的增殖能力。结果发现,与对照siRNA相比,敲低TGFBI的巨噬细胞显著抑制了肿瘤细胞的增殖。这表明TGFBI是巨噬细胞促进肿瘤生长的重要因子。 为进一步验证TGFBI的作用,研究者加入重组TGFBI蛋白到体系中,发现添加TGFBI可以部分阻断敲低TGFBI对巨噬细胞功能的影响,肿瘤细胞增殖能力得以恢复。这再次证实TGFBI可以作为巨噬细胞分泌的因子参与调控肿瘤细胞增殖。此外,研究者还直接在肿瘤细胞中检测了TGFBI的作用,结果发现重组TGFBI蛋白可以促进肿瘤细胞增殖和增殖相关基因的表达。 综上,通过体外实验,研究者证明敲低巨噬细胞TGFBI的表达可以抑制胰腺癌细胞增殖,TGFBI可以作为巨噬细胞的分泌因子调控肿瘤细胞生长。
5敲低TGFBI表达的巨噬细胞可以抑制小鼠体内肿瘤生长,并改变肿瘤微环境中细胞因子和细胞外基质蛋白的表达。 在体外实验中已经证明敲低巨噬细胞TGFBI可以抑制肿瘤细胞增殖,研究者接着要验证这一发现是否也适用于体内。他们采用小鼠肿瘤模型进行研究。先用siRNA敲低骨髓来源巨噬细胞中的TGFBI,然后将这些巨噬细胞与肿瘤细胞混合共同移植到小鼠胰腺组织中。结果发现,与对照siRNA处理的巨噬细胞相比,敲低TGFBI的巨噬细胞显著抑制了肿瘤的生长。流式结果也显示,敲低TGFBI的巨噬细胞促进了肿瘤组织中CD8 T细胞的浸润。 研究者进一步检测了不同处理下肿瘤中的基因表达变化。结果发现,敲低TGFBI的巨噬细胞抑制了肿瘤中细胞外基质相关蛋白COL2A1、FN1的表达,增加了促进免疫应答的细胞因子IRF7、IFN-γ的表达。这表明TGFBI可以通过调节肿瘤微环境中细胞因子和基质蛋白的表达影响肿瘤的生长。 综上,通过小鼠肿瘤模型,研究者证实了敲低巨噬细胞TGFBI不仅可以抑制肿瘤生长,还可以改善肿瘤的免疫微环境。
6通过Cre重组酶病毒体内敲低巨噬细胞TGFBI表达,发现可以抑制小鼠胰腺癌的生长。 为了开发针对TGFBI的肿瘤治疗方法,研究者构建了TGFBI基因敲除小鼠模型。他们使用CRISPR/Cas9技术在小鼠TGFBI基因组DNA的exon 3区插入loxP位点,得到TGFBI flox/flox小鼠。这种小鼠表达正常的TGFBI,但在Cre重组酶的作用下,TGFBI的exon 3区会被切除,导致基因敲除。 然后研究者用载有Cre基因的重组腺相关病毒(AAV8-mCD68-Cre)体内感染TGFBI flox/flox小鼠,以特异性敲低巨噬细胞中的TGFBI表达。结果发现,与对照病毒处理相比,Cre病毒处理明显抑制了小鼠胰腺癌的生长。流式结果显示Cre病毒处理导致肿瘤相关巨噬细胞中M1型巨噬细胞(CD86阳性)的比例升高,M2型巨噬细胞(CD206阳性)的比例降低。此外,肿瘤组织中PD-1阳性的CD4 和CD8 T细胞的比例也降低了。 综上,研究者通过体内特异性敲低巨噬细胞TGFBI的表达,证实了靶向TGFBI可以抑制胰腺癌的生长。
7在小鼠模型中,联合敲低巨噬细胞TGFBI表达和吉西他滨化疗,可以产生协同增效的抗肿瘤作用。 研究者探究了敲低巨噬细胞TGFBI表达是否可以增强化疗药物吉西他滨对胰腺癌的治疗效果。他们在TGFBI基因敲除小鼠模型中,先用载有Cre的重组病毒体内敲低巨噬细胞TGFBI,再进行吉西他滨化疗。结果发现,与单独给予吉西他滨相比,联合敲低巨噬细胞TGFBI和吉西他滨化疗可以显著抑制肿瘤生长。 研究者进一步探究了联合治疗的机制。结果发现,吉西他滨化疗单独使用会抑制肿瘤组织中CD8 T细胞的数量和活性,增加M2型巨噬细胞的比例;而敲低巨噬细胞TGFBI可以逆转吉西他滨对免疫系统的不利影响,增强其抗肿瘤免疫应答。 综上,研究证明敲低巨噬细胞TGFBI表达可以协同增强化疗的疗效,为胰腺癌的联合治疗提供了新的策略。
8研究发现TGFβ/TGFBI/Fn1轴参与调控巨噬细胞的功能。 为了进一步阐明TGFBI调控巨噬细胞功能的下游机制,研究者对敲低TGFBI表达的巨噬细胞进行了全transcriptome测序。结果发现,与对照相比,敲低TGFBI表达导致巨噬细胞中许多细胞外基质相关基因(如Fn1等)表达下调,而许多细胞因子和免疫激活相关基因表达上调。这提示TGFBI可能通过调节基质蛋白和细胞因子的表达影响巨噬细胞功能。 研究者进一步通过实验验证了Fn1是TGFBI调控的下游靶点。敲低TGFBI可以抑制Fn1的表达;而敲低Fn1对TGFBI mRNA水平无影响,说明Fn1是TGFBI的下游靶点。功能实验也显示,添加重组Fn1蛋白可以部分阻断TGFBI敲低对巨噬细胞功能的影响。此外,研究还发现TGFBI和Fn1可以直接作用于T细胞,抑制其增殖和促进耗竭。 综上,TGFBI可以通过TGFβ信号通路调控Fn1等细胞外基质蛋白的表达,进而影响巨噬细胞功能。
研究结论： 本文通过单细胞RNA测序等技术手段发现,TGFBI主要由肿瘤相关巨噬细胞表达并分泌。TGFBI可以促进巨噬细胞向M2型极化,并作为分泌因子直接促进胰腺癌细胞的增殖。在小鼠模型中,靶向敲低巨噬细胞TGFBI表达可以抑制肿瘤生长,改善肿瘤微环境。该研究表明TGFBI是连接巨噬细胞与胰腺癌细胞的关键分子,靶向TGFBI可能成为胰腺癌治疗的新策略。 |
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