颠覆先前的认知，首次系统获得新冠病毒转录组及表观转录组学数据

2020年4月8日，韩国基础科学研究所Dongwan Kim等人在Cell在线发表题为“The architecture of SARS-CoV-2 transcriptome”的研究论文，该研究利用两种互补的测序技术，展示了SARS-CoV-2转录组和表观转录组的高分辨率图。

DNA纳米孔测序表明，由于许多不连续的转录事件，转录组非常复杂。除了典型的基因组RNA和9个亚基因组RNA，SARS-CoV-2还可产生编码未知ORF且具有融合，缺失和/或移码的转录本。使用纳米孔直接RNA测序，该研究进一步在病毒转录本上找到了至少41个RNA修饰位点，具有最频繁的基序AAGAA。修饰的RNA比未修饰的RNA具有较短的poly（A）尾巴，表明修饰和3'尾巴之间存在联系。在这项研究中发现的未知转录本和RNA修饰的功能研究将为我们对SARS-CoV-2的生命周期和致病性的理解开辟新的方向。

由于新病例的迅速增加，2019年冠状病毒病（COVID-19）很快引起了全球关注。新型冠状病毒感染被认为是从动物传播的，病原体被鉴定为SARS-CoV-2。到2020年1月，怀疑最初受感染的患者是通过人与人之间的传播感染了该病毒。自2020年1月以来，该病毒已迅速传播到中国大部分地区和其他国家。截至2020年4月8日，全球确诊病例累计超过140万例，死亡8万余例。这些数字每天都会更新，而且预计还会进一步增加。

冠状病毒携带所有RNA病毒家族中最大的基因组（26–32 kb）。每个病毒转录物均具有5'-cap结构和3'poly（A）尾巴。细胞进入后，基因组RNA被翻译以从两个开放阅读框（ORF），产生非结构蛋白（nsps）ORF1a和ORF1b。ORF1a产生多肽1a（pp1a，440-500 kDa），被裂解为11 nsps。-1核糖体移码发生在ORF1a终止密码子的紧邻上游，这允许ORF1b继续翻译，从而产生大多肽（pp1ab，740–810 kDa），被切割成16 nsps。蛋白水解切割由分别具有木瓜蛋白酶样蛋白酶结构域和3C样蛋白酶结构域的病毒蛋白酶nsp3和nsp5介导。

SARS-CoV-2基因组组织，规范的亚基因组mRNA和病毒体结构的示意图（图源Cell ）

病毒基因组还被用作复制和转录的模板，由具有RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP）活性的nsp12介导。 产生负义RNA中间体，以用作合成正义基因组RNA（gRNA）和亚基因组RNA（sgRNA）的模板。gRNA由结构蛋白包装以组装后代病毒体。较短的sgRNA编码保守的结构蛋白【刺突蛋白（S），包膜蛋白（E），膜蛋白（M）和核衣壳蛋白（N）】和一些辅助蛋白。根据当前注释，已知SARS-CoV-2具有六个辅助蛋白（3a，6、7a，7b，8和10）。但是ORF尚未通过实验验证其表达。因此，目前尚不清楚该紧凑基因组实际上表达了哪些辅助基因。

每个冠状病毒RNA都包含约70 nt的5'“前导”序列，该序列与基因组下游部分的“主题”序列融合。根据相关的模型，前导序列-主体融合发生在负链合成过程中的短基元，称为转录调控序列（TRS），紧邻ORF。TRS包含一个保守的6-7 nt核心序列（CS），周围是可变序列。在负链合成过程中，RdRP在穿过体内TRS时会暂停（TRS-B），然后将模板切换到前导体中的TRS（TRS-L），这会导致转录不连续，从而导致前导-主体融合。从融合的负链中间体中转录出正链mRNA。已经在其他冠状病毒中研究了复制和转录机制。但是，尚不清楚一般机制是否也适用于SARS-CoV-2，以及SARS-CoV-2转录组中是否存在未知成分。为了开发诊断和治疗工具以及对这种新病毒的理解，定义SARS-CoV-2基因组的组织至关重要。

深度测序技术提供了研究病毒转录组的强大手段。诸如Illumina和MGI平台之类的“合成排序（SBS）”方法具有很高的准确性和覆盖范围。但是它们受到短读长度（200-400 nt）的限制，因此应通过计算重新组装片段化的序列，在此期间会丢失单倍型信息。最近引入的是基于纳米孔的直接RNA测序（DRS）方法。尽管纳米孔DRS的测序准确性受到限制，但它可以进行长读测序，这对于分析长的CoV转录本特别有用。此外，由于DRS可以检测RNA而不是cDNA，因此可以在测序过程中直接获得RNA修饰信息。已发现许多RNA修饰可控制真核RNA和病毒RNA。末端RNA修饰（例如RNA拖尾）在细胞和病毒RNA调节中也起着至关重要的作用。

在这项研究中，研究人员结合了两种互补的测序方法，即DRS和SBS。该研究明确地绘制了SARS-CoV-2的sgRNA，ORF和TRS。此外，研究人员发现了许多与常规TRS介导的聚合酶跳跃不同的非常规RNA连接事件。该研究进一步发现了RNA修饰位点，并测量了gRNA和sgRNA的poly（A）尾巴长度。

测序数据统计（图源Cell ）

具体来说，该研究利用两种互补的测序技术，展示了SARS-CoV-2转录组和表观转录组的高分辨率图。DNA纳米孔测序表明，由于许多不连续的转录事件，转录组非常复杂。除了典型的基因组RNA和9个亚基因组RNA，SARS-CoV-2还可产生编码未知ORF且具有融合，缺失和/或移码的转录本。

使用纳米孔直接RNA测序，该研究进一步在病毒转录本上找到了至少41个RNA修饰位点，具有最频繁的基序AAGAA。修饰的RNA比未修饰的RNA具有较短的poly（A）尾巴，表明修饰和3'尾巴之间存在联系。在这项研究中发现的未知转录本和RNA修饰的功能研究将为我们对SARS-CoV-2的生命周期和致病性的理解开辟新的方向。

参考消息：

DOI: 10.1016/j.cell.2020.04.011