卒中术后脑组织病理学评估 - H&E染色

1.冰冻切片苏木素伊红染色

1

将4%多聚甲醛灌注后的大脑，用冰冻切片机切片，厚度为10~40微米。

2

将脑片贴在载玻片上，并且吹干过夜。

3

将脑片脱脂（若是脑组织直接冰冻，则不需要脱脂）：

（a）将脑片浸没在氯仿和100%乙醇混合物中至少1小时。

（b）将脑片分别在100%、95%、70%和50%的乙醇中各浸泡5分钟，然后用蒸馏水冲洗。

注意：必须等到片子完全干燥（没有水滴）。如果脑片是几天前准备的，在染色之前必须放到蒸馏水中浸泡5分钟。

4

染色步骤：

（a）将苏木素滴在脑片上，染色20~25分钟。整个过程用眼睛或显微镜观察，保证细胞核变蓝。

（b）用蒸馏水洗2次。

（c）用0.25%的氨水溶液轻轻冲洗约10秒。

（d）用蒸馏水洗2次。

（e）用伊红染色10秒

（f）用蒸馏水洗2次。

（g）用70%、80%、90%、95%、100%的乙醇脱水1次，每次3分钟。

（h）用100%乙醇与二甲苯混合液脱水3分钟。

（i）用二甲苯处理5分钟

（j）滴2~3滴封片剂，用盖玻片封住脑片，准备在显微镜下观察。

2.石蜡切片的苏木素-伊红染色

1

修剪组织：如果大脑固定在4%6的多聚甲醛里，那么修剪组织必须在通风橱里进行。去除小脑和嗅球部分。大脑用水冲洗干净，冠状切片切成3份。组织放在生理盐水中。

2

处理以及石蜡包埋：在自动包埋机上进行包埋。金属盒放在机器中过夜。组织进行梯度脱水，并用石蜡进行包埋。

3

组织包埋的步骤:

（a）加热温度控制在59~61℃；

（b）样品控制台温度在59~61℃；

（c）冷冻台温度为5℃；

（d）组织转移到加热台上，浸在石蜡中，然后移至样品控制台。

注意：不要把样品放反了，同时要保持它们的方向一致。把铁块放在冷冻台上，冷却20分钟。

4

室温下在切片机上切片：

（a）水浴温度控制在45~50℃。

（b）石蜡组织放在冰水混合物中。

（c）室温下设置好切片机。

（d）45℃，吹干载玻片20分钟。

（e）蜡块固定在切片机上，修整蜡块表面，直至大脑组织出现。

（f）切片，厚度可根据试验要求，切成4~10微米。

（g）脑片转移到水浴中，然后贴在载玻片上。

5

预染：载玻片在60℃的烘箱中烤片15分钟，融化石蜡，使乙醇挥发。注意用架子架住载玻片。

6

HE染色：可以自动也可以手动进行。

1）自动：染色在染色机中进行，依次用以下溶液处理：

（a）3次二甲苯；

（b）2次100%乙醇；

（c）2次95%乙醇；

（d）苏木素染色；

（e）2次95%乙醇；

（1）70%乙醇；

（g）伊红染色；

（h）70%乙醇；

（i）3次二甲苯。

2）手动：每一步骤约1~2分钟，整个过程需要25~30分钟。载玻片放入盒子中，滴2~3滴封片剂，然后用盖玻片小心地盖在上面。

① 注意事项：

（a）封片前片子不要干燥，封片剂将永久地封住脑片；

（b）在完全干燥之前保证片子平整；

（c）在显微镜下观察片子的染色效果。例如：如果组织在冰盒中的浸泡时间不足够长，组织看起来会有皱褶。如果漂片温度太高，片子会碎，如果温度太低，片子不能漂浮。

② 手动的HE染色方法：

（a）3次二甲苯，每次2分钟，脱去脂肪和蜡；

（b）100%乙醇，每片10滴；

（c）95%乙醇，2次，每片10滴；

（d）蒸馏水洗；

（e）苏木素染色15分钟；

（f）蒸馏水洗2次；

（g）0.25%氨水洗，直至组织变蓝；

（h）蒸馏水洗2次；

（i）0.5%的伊红染色，每片10~20滴；

（j）95%乙醇，洗2次，每片10~15滴；

（k）100%乙醇，每片10滴；

（l）3次二甲苯，每片10滴。

苏木素伊红染色后细胞核呈蓝色，细胞质呈粉红色或红色。如下图所示：