【原】小鼠脑常规病理学检测（石蜡切片HE染色protocol）(4/6)

一、标本的采集（心脏灌注）

  灌胃结束后的水迷宫检测完毕以后，用360 mg/kg剂量的10%水合氯醛对各组小鼠腹腔注射，麻醉后腹部朝上，迅速剪开胸腔，暴露心脏，将注射器刺入左心室，同时剪开右心耳，先用生理盐水灌注，直至右心耳流出液体清亮无血色，然后用4%多聚甲醛(_PH=7.4 ) 快速灌注，以四肢抽搐肝脏发白为准。剪开颅骨，用镊子小心取出完整大脑，置于10%甲醛液中固定2 d。

二、载玻片预处理

  将载玻片用洗衣粉水浸煮2 h，取出在流水下冲洗干净，置于60 ℃烘箱摊开烤干，在酸洗液中浸泡过夜，第二天取出用大量清水冲洗，最后用双蒸水冲洗两遍，放入60 ℃烘箱烘烤，然后置于95%酒精中浸泡，用前取出载玻片，用高压灭菌过的干净稠布擦拭干净，涂10 µL 0.01% PLL于载玻片上，以推血片方式均匀涂开，37 ℃生化箱中干燥后置于4 ℃冰箱中保存备用。

三、石蜡包埋

  将固定好的脑组织取出，经流水漂洗过夜，次日进行石蜡包埋，步骤如下：70%乙醇1 h → 80%乙醇1.5 h → 90%乙醇1.5 h → 95%乙醇（Ⅰ）45 min → 95%乙醇（Ⅱ）45 min → 100%乙醇（Ⅰ）45 min → 100%乙醇（Ⅱ）45 min → 二甲苯（Ⅰ）30 min → 二甲苯（Ⅱ）30 min → 熔蜡（Ⅰ）1.5 h → 熔蜡（Ⅱ）2 h →包埋。

四、切片制备

  将包埋好的蜡块在Leica石蜡切片机上进行冠状切片，片厚4 µm，范围包括皮层、海马，42 ℃温水中展片并用处理过的载玻片捞片，37 ℃生化箱中烘烤过夜使载玻片与蜡片黏贴牢靠防止脱片，烘烤后的切片放入4 ℃冰箱中密封保存，用于常规病理染色和免疫组化检测。

五、HE染色

将上述切片按照下面的步骤操作：

1)石蜡切片脱蜡至水：二甲苯（Ⅰ）12 min→二甲苯（Ⅱ）12 min→100%乙醇（Ⅰ）3 min→100%乙醇（Ⅱ）3 min→95%乙醇3 min→90%乙醇3 min→80%乙醇3 min→70%乙醇3 min→蒸馏水8 min；

2)苏木精室温染色1 min→自来水浸洗返蓝8 min→蒸馏水冲洗3min；

3)切片脱水透明：70%乙醇3 min→80%乙醇3 min→90%乙醇3 min→1%伊红染色1 s→95%乙醇3 min→100%乙醇（Ⅰ）3 min→100%乙醇（Ⅱ）3 min→二甲苯（Ⅰ）4 min→二甲苯（Ⅱ）4 min→中性树胶封片→镜验。

  苏木精伊红染色中要时常在显微镜下观察染色的深浅，以便及时调整，结果应是细胞核被苏木精染成蓝色，核仁分明，伊红使细胞质着色，将其染成红色，蓝色的细胞核和红色的胞浆对比鲜明。

六、统计分析

  每组随机选取4只小鼠的蜡块进行切片，每只选2张不相邻切片即每组共8张进行HE染色，每张切片随机选取10个非重叠高倍视野(×400)统计每张切片中正常海马锥体细胞（指的是细胞核大而圆，苏木精着色浅而清晰，核仁核膜明显，胞质丰富的锥体细胞）数目后取平均值作为计数结果。

  采用SPSS 17.0分析软件对统计结果进行处理，数据采用单因素方差分析，用均数±标准差（±s）表示，组间采用LSD比较，P<0.05为具有显著性差异，P<0.01为极其显著性差异，图表由Excel 绘制。

附.试剂配制

1)苏木精染液（Mayer 法）：将0.1 g苏木精溶于100 ml蒸馏水中，并煮沸溶解，加入5 g钾明矾和0.02 g碘酸钠，搅拌至溶解，再加入0.1 g的枸橼酸和5 g的水合氯醛，完全溶解后加热煮沸大约5 min，冷却，过滤，室温静置，次日可用；

2)1%伊红：称取伊红0.5 g，加入到50 ml 95%乙醇中，完全溶解；

3)10%水合氯醛：称取水合氯醛5 g，用50 ml双蒸水溶解；

4)PBS缓冲液：称取NaCl 9 g，Na₂HPO₄·12 H₂O 6 g，NaH₂PO₄·2 H₂O 0.4 g，蒸馏水溶解后定容至1000 ml，PH=7.4；

5)4%多聚甲醛：取多聚甲醛4 g，PBS缓冲液溶解，并定容至100 ml;

6)重铬酸钾酸洗液：称取50 g重铬酸钾粉末，溶解在100 ml蒸馏水中，少量多次加入浓硫酸（98%）900 ml并不断搅拌。