放化疗会导致肿瘤突变负荷（TMB）升高？

目前，化疗和放疗仍然是肿瘤的重要治疗手段。但是放化疗的选择性较差，在治疗癌症的同时会导致一些正常细胞的死亡；同时放化疗引起的DNA损伤，进而导致肿瘤和正常细胞发生体细胞突变，可能是化疗造成一些长期副作用的原因。随着免疫治疗的兴起，免疫治疗联合化疗或放疗也成为临床研究的热门选项，其背后的一种猜想是放化疗可能诱发更多的体细胞突变，导致肿瘤突变负荷（TMB）升高，进而增加免疫治疗的敏感性。

这种推测究竟是否成立呢？化疗或者放疗究竟会不会导致肿瘤突变负荷（TMB）升高，进而为免疫治疗助力呢？

近日，来自巴塞罗那生物医学研究所等机构的科学家们在顶级期刊Nature Genetics 上发表重要研究论文^[1]，该文可以帮助我们了解放化疗引起的突变究竟有多少，并进一步解答了其对TMB的影响。文章核心结论抢先看：

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1. 化疗和放疗会在细胞DNA上留下不同的突变印记；

2. 针对化疗重点分析，发现化疗会诱发大量突变：在相同的暴露时间下其引起的突变率可达由于衰老引起的突变率一百倍以上；

3. 但是，由于这些突变绝大多数不影响蛋白质编码，在临床治疗的有限周期内，对TMB的变化影响很小。因此，对因化疗引起TMB变化进行动态监控恐怕意义有限；

4. 放疗是否可以引起大量突变继而对TMB造成影响本研究并未给出明确答案，未来或许可以参考本文思路成为进一步的研究方向。

研究深入解读

要想研究由于放化疗引起的肿瘤突变，那么最简单的方法就是取到同一个患者的治疗前和治疗后的肿瘤组织做比较。然而我们都知道这样的取样难度会非常大，因此研究者对取样和分析做了非常巧妙的设计，仅检测患者的一份组织便可以鉴定出哪些突变是由放化疗引起的。

首先，研究人员对实验样本进行了严谨的筛选，选择经过抗肿瘤治疗之后的转移灶作为研究对象。

治疗方式所诱导的突变，随机独立的分布在每个细胞中。当对整个组织的细胞进行测序的时候，虽然突变数量可能很多，但由于每一个突变都只有极少数细胞携带，是无法被检测到的。因此，这种治疗诱导的突变只有当携带的细胞又经过大量克隆扩增之后才有可能被检测到。所以，研究人员选择了3506例经过抗肿瘤治疗之后的转移灶作为研究对象，在全基因组水平进行测序，让鉴定这些突变成为可能（图1）。

图1. 研究过程

在转移灶取样前，患者使用抗肿瘤治疗的中位时间为2.33年。治疗方式分布在58大类206种已获FDA批准的治疗方式之中。治疗方式的选择主要依据肿瘤的起源部位，1848名患者用过其中两种及以上药物。

第二，研究人员通过突变谱宏观的碱基变化特征来分析暴露因素诱发突变的作用。

不同的治疗方式和环境因素造成变异的碱基变化特征不同，这种特征被称为突变特征或突变印记（mutation signature）。通过对突变印记的分析，可以还原出诱发患者体细胞突变的原因，例如C→A颠换是肺癌中和吸烟相关的突变印记，然而C→T转换是紫外线辐射暴露的皮肤癌症相关的突变印记。

通过3506个转移灶的全基因组测序，研究人员检出约6800万个单碱基突变（SBS），约90万个双碱基突变（DBS）和约1100万个插入缺失突变（Indel），其中很多突变位点以前也被发现过^[2-4]。

结合所有患者的治疗信息，通过突变印记分析，研究人员分析了治疗方式与变异之间的关系，确定了4种抗癌疗法相关的7种突变印记有显著富集。包含6种与3种铂类药物（顺铂，卡铂和奥沙利铂）相关的突变印记（图2a），和1种新发现的突变印记与卡培他滨5-FU治疗有关，特征为明显的CTC>CGC和CTT>CGT突变（图2b）。

值得一提的是，与化疗引起的突变印记不同，放疗引起的体细胞突变主要以短片段缺失（small deletion）和平衡倒位（balanced inversion）为主要特征^[7]。在本研究中也看到了类似的现象（图2c）。

图2. 治疗方式相关的突变印记。a）6个已知与三种铂类药物相关的突变印记；b）新发现与卡西他滨／5-FU治疗相关的突变印记；c）与放疗相关的indel突变印记

第三，研究人员以衰老等内源性因素为对照，从另一方面证明了化疗对突变印记的作用

假设上述突变确实由于化疗诱导生成，从进化的角度讲，它们应该在肿瘤发展晚期才会出现，这是与衰老等内源性因素导致的变异的明显区别。

分析结果验证了作者的假设，与化疗相关的突变显著富集于肿瘤治疗后期和继发性亚克隆中；治疗周期长的患者相关突变数量显著高于治疗周期短的患者（图3）。衰老等内源性因素导致的变异则没有这个现象。

图3. 治疗相关的变异特征。a）7种化疗相关突变印记的诱导变异显著富集于治疗过程后期，衰老和吸烟相关变异无此现象；b）7种化疗相关突变印记的诱导变异显著富集于肿瘤继发性亚克隆中，衰老和吸烟相关变异无此现象；c）治疗周期长的患者化疗相关突变数量显著高于治疗周期短的患者

以上结果再次证明，前面发现的突变印记确实是抗肿瘤治疗引起的。

最后，以衰老为内源性对照，定量计算了化疗对TMB的影响很小

免疫细胞通过识别肿瘤细胞呈递的新抗原来启动免疫应答，特异性杀伤肿瘤细胞，因此免疫治疗发挥作用的一个重要条件是肿瘤有足够多的新抗原表达。TMB本质是从DNA层面上反映肿瘤中新抗原数量的biomarker。只有位于基因编码区的非沉默体细胞变异才可能影响蛋白质编码，产生新抗原，因此化疗诱发的非沉默变异才能影响到TMB的变化。

研究人员以化疗诱发变异占比较高的结直肠癌进一步分析，从数据角度估算出衰老导致的每1000个突变中，有33.53个会影响基因的编码，其中1.47个位于已知的癌症相关基因。而由奥沙利铂引起的1000个突变中，预计有12.27个会影响编码基因的序列，而只有0.6个位于已知癌症基因（图4）。可以看出，化疗诱导突变引起的TMB变化，对肿瘤免疫原性的影响低于肿瘤内源性变化（衰老）产生的突变，文章并未给出这一现象的原因，这会是一个值得进一步研究的有意思的课题。

图4. 化疗引起编码突变的风险

最后，作者计算了患者在真实的临床化疗场景中可能会发生的编码基因变异的数目，用奥沙利铂治疗21周的肠道肿瘤，会诱发20个影响基因编码的变异（图5），这相当于全外显子组TMB数值大约增加0.6个突变/Mb。由此可见，虽然化疗确实会诱发突变，但是在临床化疗场景，对于患者治疗过程中TMB的影响是很小的。

图5. 真实化疗环境中，不同癌种患者编码基因变异数目的改变

小结和启发

本研究中作者首次描述了化疗和放疗会在DNA上留下治疗方式相关的突变印记，并且化疗会诱发大量突变。但需要注意的是，这些突变绝大多数不影响蛋白质编码，在临床治疗的有限周期内，对TMB的影响很小。因此临床上对放化疗引起的TMB变化进行动态监控恐怕意义有限。

多项临床研究表明免疫联合治疗与单独化疗相比预后均有获益（KEYNOTE-189、KEYNOTE-407研究等），化疗增强免疫疗效的机制也许并不在于化疗带来的TMB改变。而化疗与免疫治疗协同作用的机制，包括对肿瘤抗原识别、细胞因子的影响，以及对肿瘤微环境中免疫细胞的作用，这些因素值得进一步深入研究。

本研究重点针对化疗所引起的突变做了分析，而放疗是否可以引起大量突变继而对TMB造成影响，本研究并未给出明确答案，未来或许可以参考本文思路成为进一步的研究方向。

参考文献

1. Oriol Pich, Ferran Muinos, Martjin Paul Lolkema, et al. The mutational footprints of cancer therapies. Nat. Genet, 2019.

2. Alexandrov, L. B. et al. Signatures of mutational processes in human cancer. Nature 500, 415-421 (2013).

3. Alexandrov, L. et al. The repertoire of mutational signatures in human cancer. Preprint at bioRxiv https:///10.1101/322859322859 (2018).

4. Nik-Zainal, S. et al. The genome as a record of environmental exposure. Mutagenesis 30, 763-770 (2015).

5. Helleday, T., Eshtad, S. & Nik-Zainal, S. Mechanisms underlying mutational signatures in human cancers. Nat. Rev. Genet. 15, 585-598 (2014).

6. Kucab, J. E. et al. A compendium of mutational signatures of environmental agents. Cell 177, 821-836.e16 (2019).

7. Behjati, S. et al. Mutational signatures of ionizing radiation in second malignancies. Nat. Commun. 7, 12605 (2016).

来源：燃石医学 2020-03-18