Host DNA released by NETosis promotes rhinovirus-induced type 2 allergic asthma exacerbation总结2017年5月1日发表在nature medicine（IF30.614）的一篇文章阐明了TH2型免疫应答前树突状细胞的激活过程：通过鼻病毒感染，招募中性粒细胞并产生胞外诱捕网（NETs），NETs中含有大量宿主双链DNA（dsDNA），dsDNA释放到胞外后诱导趋化因子CCL2、CCL7分泌，从而招募单核-树突状细胞聚集在上呼吸道、肺组织和纵隔淋巴结。通过其抗原提呈作用将变应原信息传递给TH2细胞，引起TH2免疫应答而加重哮喘。 背景过敏原和病毒协同作用加重哮喘的机制不明确，病毒感染主要以th1型免疫应答为主，哮喘是th2型免疫应答为主，因此猜测有其他因素参与其中。 文献资料显示，病毒感染哮喘加重期中性粒细胞增加，中性粒细胞释放胞外陷阱，内含双链DNA、组蛋白和非组蛋白（NE,MPO）。NET和DNA能被免疫系统识别激活TH2型免疫应答。 结果1.鼻病毒诱导的宿主DNA释放会加重th2细胞介导的哮喘为了确定DNA是否会在病毒感染哮喘加重期时释放，分别在人和动物中评估病毒感染、DNA释放和TH2型免疫应答之间的关系。 23名哮喘患者及11名健康受试者接种鼻病毒，收集分析鼻灌洗液。在第2、3、4、7天测试DNA浓度。感染后哮喘患者的DNA浓度显著高于正常人（图1a-c），第三天病毒滴度（病毒无dsDNA）和DNA浓度相关（图1e）。感染后TH2型免疫应答的炎症因子IL-4、IL-5、IL-13浓度与DNA浓度成正相关（图1d，g）。上下呼吸道呼吸症状评分与DNA浓度成正相关(图1f)。证明哮喘患者RV感染诱导dsDNA释放与2型免疫介导的哮喘加重程度相关.  实验采用哮喘动物模型进行研究。室内尘螨(Hdm)致敏BALB/c小鼠(“变应性”小鼠)。接种rv-1b的变应性小鼠与接种紫外线灭活RV-1b(UV)和rv-1b的非过敏性小鼠相比，表现出更严重的哮喘特征：BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞的增多、IgE浓度升高、BALF MUC5ac蛋白浓度升高、气道炎症细胞浸润增加、粘液生成和气道高反应性增加等（图2a-g）。以上相当于检测人类哮喘患者的指标。肺TH2细胞(SSClowCD3+CD4+ICOS+ST2+，图2h)与未感染的过敏性和感染的非过敏性小鼠相比，在肺中的数量和百分比更高(图2i-j）。从各组小鼠中分离出的肺和纵隔淋巴结(Mln)细胞在体外HDM再刺激，病毒感染的变应性小鼠比未感染的过敏性和感染的非过敏性小鼠产生更多的TH2细胞因子(图2k，l）。 研究在模型中接种RV后dsDNA是否被释放。模型中，RV从24h开始在气道中诱导早期的dsDNA释放，在第48h达到高峰(图2m)。接种RV24h后变应性小鼠dsDNA显著增加(图2n)。
2. 脱氧核糖核苷酸酶对RV诱导哮喘加重有缓解作用为了确定dsDNA是否会加重哮喘，用DNA酶（DNase）处理以减少胞外dsDNA累积。用DNase处理的RV感染的过敏性小鼠，BALF中嗜酸性粒细胞和淋巴细胞的数量和百分比、血清IgE浓度、BALF MUC5AC蛋白浓度、气道炎症细胞浸润、粘液生成和气道高反应性明显低于RV感染的过敏性小鼠(图3c-h）。评估TH2型免疫应答，DNase治疗减少了肺TH2淋巴细胞的数量和百分比及体外HDM刺激肺和mln细胞后产生TH2细胞因子的浓度(图3i-k)。  3. dsDNA会促进TH2型免疫反应通过单独注射外源性dsdna(脾)再现病毒驱动的2型免疫应答和哮喘病理的特征。注射dsDNA接种rv的过敏性小鼠BALF总细胞数、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞百分比、血清IgE浓度、气道炎症细胞浸润、TH2型细胞数量和百分比、肺和mln相关的2型免疫应答的炎症因子浓度比较高(图4b、c、e、h-j)。但没有表现出明显粘液分泌或气道高反应性（图4d,f,g）。 4. DNase抑制单核-树突状细胞的招募已知宿主dsdna优先作用于树突状细胞(Dc)以增强th2型免疫应答。单核细胞来源的DC被招募到肺内，随后在过敏原攻击时进入mln，以维持th2细胞对hdm的免疫。 与PBS致敏对照组相比，hdm过敏性小鼠肺内招募的mo-DC数量较高(图5b-c)，在MLN中没有招募mo-DC(图5e-f)。RV感染后，肺部和MLN中的mo-DC数量高于接种紫外线的对照组(图5c，f)。与非过敏/感染对照组相比，过敏性小鼠和RV感染小鼠的肺组织中cDC2的数量也较高，但与未感染或未感染的对照组相比，rv感染的变应性变应性小鼠中cDC2的数量并不高(图5d)。 考察DNase治疗是否影响肺和MLN中的mo-DC，研究发现DNase处理的RV感染的过敏性小鼠肺和MLN中的mo-DC数量显著降低(图5c，f)。感染过程中，由趋化因子CCL 2、CCL 7和CCL 12驱动Mo-DC的募集。RV感染的过敏性小鼠BALF中趋化因子的浓度均高于紫外线对照，DNase治疗显著降低了CCL 2和CCL 7的浓度组(图5h-j)。  5. RV诱导的NET介导哮喘恶化的机制已知病毒引起的哮喘恶化与中性粒细胞向气道迁移有关。病毒能够促进中性粒细胞分泌NETs。因此，推测RV诱导NET是dsDNA的主要来源，导致过敏性哮喘的恶化。 人气道中dsDNA的来源是RV诱导的NET(图6a，b)。动物模型重复证明(图6c，d)。 为了评价dsDNA释放对RV感染的过敏性小鼠气道中性粒细胞生成的依赖性，在RV接种前腹腔注射抗体(α-Ly6G)使中性粒细胞耗竭(图6e)。α-Ly6G可阻断RV诱导的中性粒细胞的招募(图6f)，使BALF中dsDNA降低至紫外线接种的过敏性小鼠的浓度(图6g)。 为明确RV能否诱导小鼠肺内NET，采用免疫荧光法鉴定Nets的DNA、瓜氨酸化组蛋白H3(Cit-H3)和MPO(一种净相关蛋白16)三重阳性区，WB对小鼠肺组织的Cit-H3半定量。结果表明中性粒细胞是胞外陷阱和dsDNA的来源（图6h,i）。 为避免DNase的非特异性作用，使用了一种特异性的NET抑制剂(GW311616A；中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂NEI)(图6j)。NEI不影响病毒载量(图6k)。经NEI处理的rv感染变应性小鼠过敏性气道炎症加重，包括较少的BALF总细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞(图6l)、气道高反应性(图6m)、肺th2细胞的数量和百分比以及hdm再刺激的mln细胞释放的th2细胞因子(Fig.6n，o)。  方法建立接种RV的变应性哮喘临床患者和动物模型；双链DNA试剂盒；PCR定量病毒RNA；体外细胞刺激；半定量酶联免疫吸附试验(ELISA)检测趋化因子和粘蛋白；流式细胞术；内源性DSDNA提取；WB；免疫荧光；中性粒细胞中和抗体及其蛋白抑制剂 讨论
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