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我经历过这样一段时间，似乎所有的事情都不太顺利。孜孜矻矻努力了很久的综述，以为一定会发表，却还是等到了退稿。实验刚刚上手，正打算撸起袖子大干一场时，又赶上了新冠肺炎。 应对这样的情况，我过去的经验是绝不能坐等。也就是需要找一些事情，让自己动起来，我要答案，也只能在行动中寻找。坐等是等不来的。于是，我开始读文献。既读新的文献，也读曾经读过却已不大能记得的文献。但读的文献越多，掌握的背景知识越多，越感到之前的实验设计存在很大问题，甚至从一开始，我们就可能选择了错误的方向。为什么要这样讲呢？因为大量文献已经报导过，某转录因子对某基因没有直接的调控作用。我要强调的是，有大量文献，而不是一篇，如果只是一篇，偶然性太大，并不足以说明问题。但我们选择反其道而行之，知其不可而为之。理由是，有篇文献说小鼠的某基因中有一个HSE-like。但小鼠的HSE-like与标准的HSE相似性很低，且有文献报导它并不能与某转录因子相结合。可是我们对此不管不问，想当然地以为，既然小鼠有HSE-like，那么人也应该有。不仅如此，我们继续想当然，既然某转录因子能与标准HSE结合，那么它应该能与HSE-like结合。我们是怎么做的呢？我们预测到人某基因的一个启动子，甚至连它的HSE-like序列都没有锁定（因为此前只有小鼠HSE-like的报导，没有人的报导，我们算是pioneers），草草地PCR出来一段序列，就开始做EMSA，就想要做出一个阳性的实验结果，就想看到某转录因子会与这段序列发生特异性结合，从而证明我们当初的假设。这可能成功吗？我不否认科研是一种探索，但是科研不需要三思而后行吗？ 我开始反思，不应该在没有读透文献的情况下，就开始做实验，不应该那么草率，但事已至此，想办法解决问题才是正道。疫情之下，很多事情只能暂且放下，但我也因此获得了时间。我终于可以学一学生物信息相关的一些东西，启动子的预测，转录因子结合位点的预测，我现在都有了一定程度的掌握。这些技能，在正式开始做EMSA之前，我都是不会的，但是现在又觉得没有想像中那么难。很多操作方法在百度上都可以找到，多动动手就可以了。我对过去没有来得及整理的文献知识进行了归纳和总结，理清了自己的思路。我很明白要做出一个好的实验设计，需要先作必要的准备，只能在此基础上去寻找突破口。 既然大量文献已经说了某转录因子不能直接调控某基因，那么之前的实验设计就要作调整了。经过多次讨论，几番挣扎，最后终于达成共识——两种转录因子的异源复合体调控了某基因。如果要继续做EMSA，那么我们首先就需要构建这样的异源复合体，但谈何容易呢？到目前为止，我们只是看到文献报导过这个所谓的异源复合体，可以说对它几乎一无所知，又怎么可能构建出一个异源复合体，从而将那个EMSA继续做下去呢？所以，EMSA的可行性已经不大。 我为了做那个EMSA，花了很多的时间，从找那段HSE-like开始，到准备各种实验材料（期间学会了做PCR，学会了割胶提取DNA，学会了配置各类缓冲液，学会了退火生成双链DNA等等，这些都是EMSA前期的一些准备工作），到最后做实验，不可谓不认真，但现在只能放弃。 两个导师对我的建议是，现在应该将重点放在ChIP-Seq上，放在基因敲除小鼠上。做ChIP-Seq可以获得大量信息，很可能会有所发现，当然只是很可能，并不意味着必然。而基因敲除小鼠是另一个大胆的尝试，这个模型早在1998年就建立起来了，只是别人的关注点跟我们不一样，我们是想知道那个基因敲除掉之后，会不会对某个蛋白质的表达造成影响。做ChIP-Seq，需要先对小鼠的生精细胞作分类和分离，虽然我没有做过，但有系统化的方法可以参照，完全可以学习。而基因敲除小鼠，首先要解决来源问题，我没有想到的是，这个来源问题，现在成了最大的问题。国内几家公司都没有现成的基因敲除小鼠可买。如果从头开始构建模型，又需要很长的时间，仅仅构建杂合子就需要4到6个月，从杂合子到纯合子，要看运气。据我所知，我的搭档之前用杂合子小鼠构建纯合子小鼠花了半年多的时间。我的搭档甚至为此激动了很长时间，由此可见其不易。现在的关键问题是，我已经没有那么多的时间。后来，我们在MGI网站上查询到国外可以提供这种基因敲除小鼠，此外还有相应的冷冻胚胎。但是疫情期间，从国外购买活体小鼠，操作起来并不简单。导师A说现在有一个可行的办法是从国外购买冷冻胚胎，然后再做移植。导师B觉得这个方法不可行，说：“我只给人做过移植，但还没有给小鼠做过移植，这是在给我出难题啊！”那个时候，我在想一个问题，我应该具备十八般武艺，应该做一个通才，这样就没有难题了，所有的问题都会解决。过了多年以后，我还是觉得应该尊称孙悟空为师父，他实在是厉害，会72变。 看起来，实验这件事情只能从长计议了。 回到那篇被退稿的综述。这是我写的第一篇学术论文。因为是第一次写，所以模仿的程度也很高。但无论怎样，我为此付出过时间，仅仅为了解决里面几幅插图，我就自学了PS、PyMOL、AI三个软件的操作方法，前前后后花了近一个月时间。所以，我想把它救回来。再次打开稿件时，我发现了很多问题，甚至可以说是低级错误，比如中英文关键词居然都对不上。我认为它被退稿是一件值得敲锣打鼓来庆祝的事情。我觉得编辑做了一件无比正确的事情。中英文关键词都对不上的文章发表出去，岂不会贻笑大方吗？ 可能是因为又反反复复地看过了一些文献，这一次修改综述，我感到驾轻就熟，对于相关性不强的内容，进行了大刀阔斧地删除。文章篇幅减少一大半，参考文献从80多篇减到了30多篇，总共也只用了两天时间。这一次，我选择了上海交大主办的一个期刊。我第一天投稿过去，编辑第二天就给了回复，说这篇综述具有一定的临床意义，建议接受与发表，这对于我来说实在是莫大的鼓励。而就在几个月前，另外一个编辑给出的回复却是，它的临床意义不大。不管怎样，我总算对它有所交代了。 |
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