【原】值得借鉴：零代码分析加免疫组化上3分！

  大家好，今天和大家分享的是一月份发表在Genomics(IF：3.16)杂志上的一篇文章，“Systemic analysis of the expression and prognostic significance of PAKs in breast cancer”，文章中作者使用Oncomine 数据库，并结合免疫组化标本，以及多个在线分析网站，对乳腺癌中的PAKs基因家族进行了表达以及预后指标的系统分析。

systemic analysis of the expression and prognostic significance of PAKs in breast cancer乳腺癌中PAKs表达及预后意义的系统分析

一、研究背景

PAK（p21活化激酶）在多种细胞过程中起到关键作用，在部分肿瘤中，针对PAK1的抑制剂已经被证明对于肿瘤生长有着抑制作用，PAK1 mRNA的高表达也预示着结直肠癌，肝细胞癌，胃癌，头颈癌和食道小细胞癌的预后不良，家族的其他成员也在其他的肿瘤研究中显示出与预后较强的相关性。但PAK的表达以及预后价值在乳腺癌中的研究不多，因此，作者希望通过公共数据库来探究PAK的mRNA表达以及蛋白质表达水平的预后价值。

二、研究思路

三、结果解析

1、乳腺癌中PAKs家族mRNA与蛋白质的表达

通过Oncomine数据库，检测到PAKs家族在乳腺癌中与正常组织有明显的表达差异。其中PAK1，PAK2，PAK4显著上调，PAK3，PAK5显著下调。对于PAK6 mRNA水平，肿瘤组织和正常组织之间没有显著差异。

随后采用GEPIA数据库进行乳腺癌组织与正常组织的转录水平比对，发现PAK3下调，PAK4和PAK6显著上调。另外分析了PAKs与肿瘤分期的关系。（补充表1）

图1:在不同癌症中PAK mRNA表达水平的Oncomine分析。

• 颜色指示阈值（p值≤0.05；倍数变化≥2；基因表达差异排位(gene rank)≤10％；数据类型：mRNA）。与正常组织相比，红色框表示靶基因在肿瘤组织中的过表达，而蓝色框表示该基因的下调。表达的强弱用颜色深浅表示。

表1：Oncomine数据库中不同数据集的PAKs基因表达差异对比数据

图2：GEPIA数据库中PAKs的mRNA表达水平箱线图

2、免疫组化观察PAKs蛋白表达并加以验证

作者先在HPA（Human Protein Atlas analysis）网站上获得了乳腺癌中PAK家族的免疫组织切片，并在来源于90个患者的180个标本中，检测了PAK4乳腺癌组织以及附近的正常乳腺组织的蛋白表达。

图3：作者通过网站来源的免疫组化数据进行蛋白表达的观察

• 可见PAK1，PAK2，PAK4在癌组织中表达升高。

图四:样本免疫组化结果

• a图展示了免疫组化标本中，相比正常组织，PAK4在癌组织中过表达。

• b图是所有样本的免疫组化评分柱状图，可以看到两组的表达有显著的差异。

3、KM Plotter探究PAKs表达与预后指标之间的关系

通过KMplotter的分析，作者发现:

• PAK4的过表达与较差的RFS有关，PAK3、PAK5的表达与良好的RFS有关。PAK3升高与PPS不良有关。

• PAK1，PAK2，PAK6表达与乳腺癌患者的预后指标没有显著的统计学意义。

此外，作者还进行了PAK家族表达与不同乳腺癌亚型的预后关系:

• PAK1高表达与基底样型更长的OS以及更长的DMFS相关，而在管腔A型中则与较差的OS和PPS相关

• PAK3的高表达与基底样型更长的OS和RFS相关，但在两种管腔型中表现出相反的现象。

• PAK4的高表达与管腔B型较差的RFS相关，PAK6的上调与基底样型更差的RFS相关。

因此，作者还对不同ER / PR / HER2型的乳腺癌患者分析了PAK的预后价值:

• HER2-型中，PAK1的高表达与更好的RFS和DMFS相关。

• HER2-和PR-型中，PAK3的表达上调预示了较差的DMFS。

• PR +型中， 高PAK5表达预示着更长的RFS;而ER-型中，高PAK5表达预示着更短的PPS。

表2：使用KM plotter对PAKs表达进行预后分析

表3：针对不同亚型中PAKs表达与预后指标中的分析

表4：针对不同ER / PR / HER2型的乳腺癌患者分析PAK的预后价值

4、乳腺癌中PAKs基因互作与蛋白互作分析

作者在这里使用了三个网页工具分别进行了mRNA表达相关性分析，Gene层次互作分析，STRING蛋白互作分子分析:

• cBioPortal进行乳腺癌组织中mRNA表达相关性分析，发现PAK5-PAK1，PAK5-PAK3两对基因表达显现正相关，而PAK3-PAK4这一对基因表达显现负相关。

• GeneMANIA 在基因层面上分析了PAK的关系，显示所有的PAK都有共享的蛋白结构域，发现了PAK1-PAK2，PAK4-PAK5以及PAK4-PAK6之间存在物理相互作用，PAK1和PAK3以及PAK3与PAK6之间有共定位的关系。共表达只显示出PAK3-PAK5的关系，遗传相互作用中发现PAK1-PAK5的关系。

• STRING ：在蛋白表达水平上鉴定PAK的相互作用，显示PAK1在基因共现，文本挖掘和蛋白质同源性中PAK2与PAK3的相互作用。共表达只显示PAK1与PAK3的关系。并且发现PAK4在文本挖掘和蛋白质同源性方面与PAK7（PAK5）相互作用。

图5:mRNA表达相关性分析，Gene层次互作分析，STRING蛋白互作分子分析的可视化结果

5、乳腺癌患者中PAKs的遗传改变与预后指标的关系

作者通过使用cBioPortal分析了乳腺癌中PAKs的遗传改变。分析结果显示，PAKs遗传变异的百分比分别为16.88％（187/1108），15.87％（172/1084）， 分别为2.2％（18/817），0.85％（7/825）。

并使用一个数据集分析了PAK的遗传改变频率（PAK1，9％; PAK2，11％; PAK3，4％; PAK4，8％; PAK5，5％; PAK6，5％）。

随后作者进行了PAKs遗传变异病例与生存结果分析。发现具有PAKs基因改变的病例与OS恶化相关。DFS没有发现显著差异。此外，作者还建立了PAKs和50个改变的邻近基因网络。

图6:遗传改变概率图/生存分析/基因互作网络

• a）TCGA Provisional 数据集， TCGA PanCancer  数据集， TCGA Cell 2015  数据集， TCGA Nature 2012  数据集中的PAKs遗传改变。

• b）基于TCGA Provisional 数据集的PAK改变频率。 

• c）Kaplan-Meier图，比较有/无PAK基因改变的情况下的OS。 

• d）Kaplan–Meier图比较了有无PAK改变的情况下的DFS。 

• e）PAK与50个最频繁改变的邻近基因之间的基因-基因相互作用网络。

6、乳腺癌患者中PAK相关基因的功能富集分析

  作者为了研究PAK及其改变的邻近基因功能，使用Metascape分析了GO和KEGG通路。

图7 GO富集分析,KEGG富集分析以及蛋白质富集分析结果

• a-b:结果显示前20个GO富集:

• 分子功能：蛋白激酶活性，Rac GTPase结合，ephrin受体结合。

• 细胞成分：粘着斑。

• 生物学过程：Fc受体信号通路，转移酶活性的正调控，跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路，凋亡信号通路，蛋白自磷酸化，免疫应答调节细胞表面受体信号通路，参与吞噬作用，DNA生物合成过程的正向调节，蛋白水解的正向调节，凋亡过程的正向调节，肽基酪氨酸磷酸化，肌动蛋白细胞骨架组织，生长调节，心脏发育，对有机氮化合物的细胞反应。

• c-d:排名前9位的KEGG途径是ErbB信号传导途径，FcγR介导的吞噬作用，蛋白酶体，上皮细胞的细菌入侵，癌症中的MicroRNA，hippo信号传导途径，小细胞肺癌，胰岛素抵抗，麻疹。

• e-f:蛋白质-蛋白质相互作用富集分析，发现生物学功能主要与ErbB信号通路，粘着斑，Ras信号通路，蛋白酶体，爱泼斯坦-巴尔病毒感染等有关。

小结

 本篇文章也是比较简单的单基因表达结合临床的套路，作者先利用Oncomine数据筛选出PAKs基因家族在乳腺癌中差异表达，再利用GEPIA比较乳腺癌与正常组织PAKs的转录水平。通过HPA网站上的免疫组化数据观察乳腺癌中的PAKs家族蛋白表达，并用自己的标本做了免疫组化的验证。随后使用KM Plotter网站进行了多种情况下PAKs表达与预后指标的相关性分析，之后利用cBioPortal计算乳腺癌浸润癌PAKs mRNA表达相关性、GeneMANIA分析PAK基因水平关系、STRING构建PAKs蛋白家族相互作用PPI网络。文章还分析了遗传改变与预后指标的关系，同样是使用了cBioPortal以及KMPlotter网站进行，文章最后使用了metascape网站进行PAK基因家族功能富集分析，并构建了通路相关的蛋白互作网络。整篇文章相对而言实验简单，也没有任何需要代码的步骤，文章除了一组免疫组化的图片及统计图表，所有图例都来自于在线的工具。