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结核病(TB)是全球第一大感染性致死疾病[1]，严重危害成人和儿童健康，高患病率和病死率使得儿童TB成为WHO关注的焦点[2]。中国TB患者人数居世界第2位，儿童TB的防控形势也十分严峻[1]。儿童由于免疫力较弱，感染结核分枝杆菌后易迅速发展为活动性TB，且结核性脑膜炎和血行播散型肺结核的发病率较高[3]。药物化疗是治疗儿童TB的重要手段，一线药物为异烟肼(INH)、利福平、吡嗪酰胺和乙胺丁醇，但治疗中出现肝损伤等药物不良反应使得治疗被迫中断，进而影响病情控制效果[1,4]。其中，INH为引起肝损伤的主要药物[4]。研究者认为INH的代谢产物、氧化应激反应失衡及免疫反应紊乱是INH致肝损伤产生的重要原因，而年龄、性别、营养状态、肝脏基础疾病等因素可以影响肝损伤的发生[4]。近年来，随着分子流行病学及遗传学的发展，INH代谢酶、氧化应激反应及免疫反应相关基因多态性与INH致肝损伤的相关性也越来越受到关注。开展INH致肝损伤的易感基因研究，为深入了解INH致肝损伤的机制及减少成人和儿童的INH致肝损伤产生提供新线索。 1 INH致肝损伤的临床特点 已报道抗结核治疗导致儿童肝损伤发病率差异较大，研究者指出在目前世界卫生组织(WHO)指南提出的儿童一线抗结核治疗的推荐剂量下，儿童肝损伤的发生率为2.7%～27.0%[5,6]。儿童肝损伤的主要临床表现为乏力、纳差、恶心、呕吐及右季肋区不适，多发生于用药2个月内[6]。轻度肝损伤在多数情况下是无症状，只有通过检测肝功能指标——丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)才能明确，而重度肝损伤有显著ALT升高及临床表现，严重者可出现肝衰竭[6] 。 2 INH的代谢与INH致肝损伤的发病机制 目前，INH及其代谢产物引发氧化应激失衡、线粒体功能障碍及免疫反应紊乱被认为是导致肝损伤的主要途径，而INH的毒性代谢产物是其中的关键因素[4]。INH的代谢依赖于酶的作用，关键代谢酶包括N－乙酰转移酶2(NAT2)、酰胺酶、细胞色素酶(P450)及谷胱甘肽S－转移酶(GSTs)[7]。INH代谢的主要途径包括(1)通过NAT2乙酰化生成乙酰异烟肼(AcINH)；(2)通过酰胺酶水解生成异烟酸(INA)和肼(Hz)。AcINH也可水解成INA和乙酰肼(AcHz)(图1)。此外，Hz可乙酰化为AcHz和二乙酰肼(DiAcHz)。AcHz被P450(特别是P450家族2亚家族E成员1，CYP2E1)进一步氧化为活性代谢产物，而这些代谢产物最终由GSTs分解，并排出体外[7]。INH及其代谢产物(Hz和活性代谢产物)具有肝毒性，可引起肝损伤。 注：NAT2：N－乙酰转移酶2；CYP2E1：细胞色素P450家族2亚家族E成员1；GSTs：谷胱甘肽S－转移酶 NAT2：N－acetyltransferase 2；CYP2E1：cytochrome P450 family 2 subfamily E member 1；GSTs：glutathione S－transferase 免疫反应紊乱也是造成INH致肝损伤的重要机制，固有免疫应答和适应性免疫应答都参与其中。固有免疫应答中，Kupffer细胞和自然杀伤(NK)细胞等免疫细胞，释放肿瘤坏死因子α (TNF－α)和白细胞介素(IL)－1β等促炎因子及IL－10和IL－6等抗炎因子。促炎因子和抗炎因子的平衡对于肝损伤的发展具有重要意义。适应性免疫应答中，T淋巴细胞和B淋巴细胞反应在不同肝损伤情况下并不相同。研究者在轻度ALT升高的INH致肝损伤患者中发现，Th17细胞升高及IL－10＋T淋巴细胞升高，提示Th17介导的免疫应答参与肝损伤的发生，而IL－10＋T淋巴细胞发挥了免疫抑制作用，避免损伤加重[8]。同时，在INH治疗致肝衰竭的患者中，发现了INH和P450的抗体[9]，可引起重度肝损伤。 3 与INH致肝损伤相关的宿主易感基因研究 因为TB治疗的一线方案为INH与其他药物联合使用，所以研究者多关注宿主易感基因与抗结核药物致肝损伤的相关性。该领域的研究对象主要为成人，关于儿童的研究非常有限。主要研究策略为根据INH致肝损伤的机制，选择INH代谢、氧化应激及免疫反应相关基因，采用一代测序或MassARRAY方法进行基因分型，明确易感基因与抗结核药物致肝损伤的相关性。 3.1 INH代谢酶 3.1.1 NAT2 NAT2是INH代谢过程中的关键代谢酶，参与INH生物转化的3个步骤：失活(形成AcINH)、生物活化(形成AcHz)和解毒(形成DiAcHz)。根据NAT2基因7个单核苷酸多态性(SNP)位点进行NAT2乙酰化表型的划分，分为快、中间、慢3种乙酰化表型，分别携带0个、1个及2个慢乙酰化单倍体。由NAT2乙酰化单倍体在人群分布具有统计学差异：亚洲人群以快乙酰化表型为主，而欧美及非洲人群以中间/慢乙酰化表型为主[10]。本研究团队发现，中国汉族儿童中以NAT2快乙酰化表型为主(61.3%)[11]。 NAT2慢乙酰化表型严重影响INH代谢：由于INH乙酰化为AcINH减少，INH直接水解成Hz的量增加，且由AcHz转化为DiAcHz的解毒活动也减少，增加了CYP2E1代谢产生的活性代谢产物，肝毒性物质产生明显增多[7]。针对NAT2乙酰化表型与抗结核药物致肝损伤的相关性，Zhang等[12]开展了对于37项研究的 meta分析，明确了慢乙酰化表型与多种族TB患者肝损伤显著相关，为肝损伤危险因素，与Yang等[13]及Cai等[14]的meta分析结果基本一致(表1)。此外，研究者还通过全基因组关联研究(GWAS)，明确了NAT2基因rs1495741的A等位基因是泰国人群抗结核药物致肝损伤的危险因素[15]。  点击查看表格 表1 与INH致肝损伤显著相关易感基因及SNP位点突变 Table 1 Susceptibility genes and SNP significantly associated with INH induced liver injury 表1 与INH致肝损伤显著相关易感基因及SNP位点突变 Table 1 Susceptibility genes and SNP significantly associated with INH induced liver injury 注：INH：异烟肼；SNP：单核苷酸多态性；NAT2：N－乙酰转移酶2；CYP2E1：细胞色素P450家族2亚家族E成员1；GSTM1：谷胱甘肽S－转移酶μ亚型1；MnSOD：超氧化锰歧化酶；NFE2L2：核因子红细胞2相关因子2；MAFF：MAF BZIP转录因子F；IL－6：白细胞介素6；HLA－DQB1：人类白细胞抗原DQB1；AcHz：乙酰肼；ROS：活性氧 INH：Isoniazid；SNP：single nucleotide polymorphism；NAT2：N－acetyltransferase 2；CYP2E1：cytochrome P450 family 2 subfamily E member 1；GSTM1：glutathione S－transferase Mu 1；MnSOD：mangano－superoxide dismutase；NFE2L2：nuclear factor，erythroid 2 like 2；MAFF：MAF BZIP transcription factor F；IL－6：interleukin 6；HLA－DQB1：major histocompatibility complex，class Ⅱ，DQ beta 1；AcHz：acetyl hydrazine；ROS：reactive oxygen species 3.1.2 CYP2E1 CYP2E1可将AcHz进一步氧化为具有肝毒性的活性代谢产物，其编码基因的2个多态性位点，可分别被限制性内切酶PstⅠ和RsaⅠ识别，并呈现完全连锁不平衡。野生基因型RsaⅠ(＋)/PstⅠ(－)被定义为c1；2个位点中任意1个位点突变则被定义为c2 [11]。本课题组研究结果提示，以上CYP2E1基因突变在中国人群以野生型为主[11]。 在CYP2E1基因多态性与抗结核药物致肝损伤的相关性研究中，Deng等[16]对于13项研究开展meta分析发现，在多种族(亚洲人群和欧洲人群)TB患者中， CYP2E1基因c1/c1基因型携带者发生肝损伤的风险显著高于c1/c2和c2/ c2基因型携带者，在中国及韩国人群中以上相关性更加显著(表1)。Cai等[14]通过meta分析发现，c1/c1基因型为东亚人群的肝损伤的危险因素，在印度、欧洲及其他人群未观察到这种关联有统计学意义(表1)。Yang等[13]的meta分析结果提示，c1/c1基因型与多种族人群的肝损伤相关，与东亚人群肝损伤的相关性更加显著(表1)。 3.1.3 GST GST家族中的μ亚型GSTM1和θ亚型GSTT1可将INH代谢产生的肝毒性物质与谷胱甘肽共价结合并排出体外，发挥解毒作用[17]。若编码基因缺失，将会引起GSTM1和GSTT1酶活性降低甚至失活，引发肝损伤[18,19,20]。在亚洲人群中，GSTM1和GSTT1基因完全缺失型(突变型纯合子)频率不同，中国人、马来西亚人和印度人GSTM1基因突变型纯合子频率分别为35%～63%、62%～100%和20%～79%；GSTT1基因突变型纯合子分别为58%、38%和39%[21]。本研究团队在中国汉族儿童中发现，GSTM1和GSTT1基因突变型纯合子(59.3%和58.4 %)的频率高于杂合子(34.0%和35.1%)和野生型纯合子(6.7%和6.5%)[22]。 在GSTM1和GSTT1基因缺失与抗结核药物致肝损伤的相关性研究中，Tang等[17]通过meta分析发现：GSTM1基因缺失显著增加亚洲人群和欧洲人群肝损伤的风险，其中与中国人群肝损伤风险增加的相关性更加显著(表1)。Yang等[13]及Cai等[14]对于多种族总体meta分析结果与上述结果基本一致，但在人群分层后，Cai等[14]发现，GSTM1基因缺失与东亚人群肝损伤风险增加的相关性有统计学意义，但与欧洲及印度人群相关性无统计学意义，而Yang等[13]则认为，GSTM1基因缺失与印度人群肝损伤风险增加的相关性有统计学意义(表1)。此外，Tang等[23]及本课题组[18]并未在中国人群中发现GSTM1基因缺失与肝损伤相关。3项meta分析研究，均未发现GSTT1基因缺失与抗结核药物致肝损伤相关[13,14,17]。 3.2 氧化应激反应 目前，研究者认为参与氧化应激反应的超氧化锰歧化酶(MnSOD)及核因子E2相关因子2(Nrf2)－抗氧化反应元件(ARE)通路相关基因与抗结核药物致肝损伤相关[4]。 3.2.1 MnSOD INH及其活性代谢产物可导致活性氧(ROS)产生和积累，而MnSOD是线粒体中清除ROS的关键酶，将其还原为过氧化氢(H2O2)，再被谷胱甘肽过氧化物酶或过氧化氢酶进一步还原为水[24]。在MnSOD基因多态性与抗结核药物致肝损伤的相关性研究中，最受关注的SNP位点为rs4880，使缬氨酸被丙氨酸取代，改变线粒体靶向序列的螺旋结构，引起线粒体基质中的MnSOD过多，产生更多有毒的H2O2，超出细胞解毒能力，引发肝损伤[25]。在中国台湾人群中，研究者发现，携带rs4880位点TC/ CC基因型TB患者发生肝损伤的风险显著高于TT基因型携带者[25](表1)。尽管如此，研究者在中国大陆人群中未发现rs4880位点C等位基因与肝损伤的风险升高相关[26]。 3.2.2 Nrf2－ARE通路 Nrf2－ARE通路相关基因多态性与抗结核药物致肝损伤的相关性也越来越受到关注。INH代谢产生的Hz和AcHz，经过CYP2E1等酶的作用，产生ROS及活性氮(RNS)，诱导型一氧化氮合成酶(iNOS，NOS2A基因编码)产生的一氧化氮(NO)也出现升高，引起肝细胞损伤[24] 。生理状态下，GST、NAD(P)醌脱氢酶1(NQO1)、血红蛋白加氧酶(HO1)等多种抗氧化酶可快速消除ROS/RNS。多种转录因子可调节抗氧化酶基因启动子区的ARE，包括Nrf2(NFE2L2基因编码)、BTB－CNC异体同源体1(Bach1，BACH1基因编码)、小Maf碱性亮氨酸拉链蛋白(MAFF、MAFG、MAFK基因编码)[4]。Nrf2－ARE通路中，抗氧化激活途径为Nrf2和小Maf蛋白形成的异源二聚体，并与ARE结合；抑制途径为Bach1和小Maf蛋白形成的异源二聚体，并与ARE结合或者ECH结合蛋白1与Nrf2结合，抑制Nrf2入核[4]。 针对Nrf2－ARE通路相关基因与抗结核药物致肝损伤的相关性，Chen等[27]在中国人群中发现，携带NFE2L2基因rs4243387位点T/C基因型及rs2001350和rs6726395位点CC单倍体的TB患者肝损伤的患病风险升高；携带MAFF基因rs2267373位点TC基因型及rs2267373、rs4444637和rs4821767位点CGC单倍体TB患者肝损伤的患病风险降低(表1)。 3.3 免疫应答 近年来，研究者发现IL－6等细胞因子及起抗原提呈作用的人类白细胞抗原(HLA)等分子的编码基因多态性与抗结核药物致肝损伤的相关。研究者在大鼠模型中发现，IL－6与INH致肝损伤后的肝细胞再生和修复密切相关[28](表1)。本课题组研究结果提示，IL－6基因启动子区转录因子结合位点rs1800796位点的G等位基因与中国汉族儿童抗结核药物致肝损伤的风险升高相关[29](表1)。Chen等[30]在中国人群中发现，携带2个HLA－DQB1*05突变型等位基因的TB患者肝损伤的风险升高(表1)。 综上，在TB治疗中，INH为导致肝损伤发生的关键药物。本文根据INH致肝损伤的机制，总结了药物代谢酶、氧化应激反应及免疫反应相关基因多态性与抗结核药物致肝损伤相关性的研究。虽然为肝损伤的研究提供了重要线索，但仍有不足：(1)研究多采用候选基因策略，缺乏高质量GWAS，无法从全基因组水平全面揭示INH致肝损伤的机制；(2)除了药物代谢酶基因外，氧化应激及免疫反应相关基因的研究比较少，样本数量有限，不同人群研究结论差异大，缺乏高质量meta分析文章作为支撑；(3)研究多局限于成人相关性的研究，缺乏儿童相关数据；(4)仅局限与基因相关性研究，对于易感基因及其多态性在细胞水平或者动物水平的功能验证，也缺乏对于临床治疗工作的指导。因此，在宿主易感基因与抗结核药物致肝损伤相关性的研究领域，亟待开展大样本多中心的GWAS，并且根据基因多态性的研究结果，优化目前的TB治疗方案。 利益冲突 利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突 参考文献 [1] World Health Organization.Global tuberculosis report 2019 [EB/OL]．(2019－10－17)[2020－01－12]．https://www./tb/publications/global_report/en/.ISBN978-92-4-156571-4. 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