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原创 生物流 2020-06-20 10:15:10 在前两篇文章中：细胞膜最简单的磷脂双分子层，行为复杂到超出你的想象（一）和 细胞膜最简单的磷脂双分子层，行为复杂到超出你的想象（二），我们讲到囊泡与细胞膜进行全融合或半融合时，超高分辨率显微镜下观察到的情况。 那么，再进一步，先融合第一层膜，再融合第二层膜的情况在细胞中同样存在。 试想一下，如果是这种情况，此时，我们在超高分辨率显微镜下会观察到怎样的过程呢？ 我们本篇文章继续探讨。 先半融合，再全融合 同样的实验设置：细胞膜内层被绿色荧光标记，细胞外部充满红色染料。 当细胞膜与囊泡膜的融合过程分为两步时： 首先，第一层膜融合：细胞膜内层与囊泡膜外层融合，即半融合。 随后，第二层膜融合：细胞膜外层与囊泡膜内层融合，即全融合。 此时，超高分辨率显微镜在x，z平面上观察到的结果是： 平坦的细胞膜（绿色），在第一次融合的瞬间，形成一个囊泡的形状；第二次融合，没有变化，仍保持囊泡的形状。 位于细胞外部的染料（红色），在第一次融合的瞬间，没有变化，没有进入囊泡内部；第二次融合，红色的染料进入绿色的囊泡内部。 细胞膜最简单的磷脂双分子层，行为复杂到超出你的想象（三） 也就是说，在这种情况下， 首先，观察到半融合状态：有绿色的囊泡结构，但内部没有红色染料； 随后，观察到全融合状态：有绿色的囊泡结构，并且红色染料进入绿色囊泡中。 实际上，在这个实验中，红色染料是通过间接的方式指示了第二层膜的融合。 强调一下，在上述的实验中，设置是这样的：用绿色荧光标记了细胞膜的内层，并在细胞膜外加入了红色染料。 现在，请你来想象一下，有没有更加直接的方式来观察膜融合的过程呢？ mCLING标记细胞膜外层 很容易想到的方法是，同时标记细胞膜的两层磷脂双分子层，一内一外，一红一绿。例如，内层用红色，外层用绿色；或者反过来，内绿外红。 我们知道，磷脂酶C位于细胞膜磷脂双分子层的内部，也就是说，标记磷脂酶C可以指示细胞膜的内层磷脂层。 那么，细胞膜的外层磷脂层能不能被标记呢？ 答案是肯定的。 2014年，德国的Silvio O. Rizzoli实验室发明了一种能够与细胞膜外层磷脂层结合的荧光团物质，称为mCLING（membrane-binding fluorophore-cysteine-lysine-palmitoyl group）。mCLING是一种荧光耦合的、人造的、小的多肽链，这里的荧光可以自行添加，如添加绿色荧光或红色荧光。 细胞膜最简单的磷脂双分子层，行为复杂到超出你的想象（三） 通过给mCLING加上荧光，可以标记细胞膜，观察到细胞膜外层磷脂的动态过程。 细胞膜最简单的磷脂双分子层，行为复杂到超出你的想象（三） 现在，我们同时具备了标记细胞膜内外两层磷脂层的荧光工具：mCLING标记外层；磷脂酶C标记内层。因此，也就有了第二种方法，来观察囊泡膜和细胞膜的融合过程。 此方法，无需在细胞外使用染料。 我们直接来看实验结果。 同时标记细胞膜的内外两层——全融合 实验设置：细胞膜内层被红色荧光标记，细胞膜外层被绿色荧光标记，囊泡膜无颜色标记。 当囊泡膜与细胞膜融合的瞬间，囊泡来不及变形。由于细胞膜的流动性，位于细胞膜内外层上的荧光蛋白（红色的PH-mCherry和绿色的mCLING-A488）会迅速移动到囊泡膜上。 超高分辨率显微镜在x，z平面上观察到的结果是： 平坦的细胞膜在与囊泡膜融合的瞬间，细胞膜内（红色）外（绿色）两层同时出现囊泡的形状。 细胞膜最简单的磷脂双分子层，行为复杂到超出你的想象（三） 同样的实验设置，如果是半融合的情况呢？ 同时标记细胞膜的内外两层——半融合 半融合，即只有细胞膜内层磷脂的红色与囊泡膜融合，而细胞膜外层磷脂的绿色没有与囊泡膜融合。 此时，超高分辨率显微镜在x，z平面上观察到的结果是： 平坦的细胞膜在与囊泡膜融合的瞬间，只有细胞膜内层（红色）出现囊泡的形状，外层（绿色）保持不变。 细胞膜最简单的磷脂双分子层，行为复杂到超出你的想象（三） 我们分析了全融合和半融合的情况，那么，现在，请你来告诉我，如果是先半融合，再全融合，会观察到怎样的过程呢？ 如果你读到了这里，那么，相信你会很容易得出答案。该问题的答案就留给读者来思考了。 实际上，我们发现，细胞膜和囊泡膜，二者的关系无外乎三种情况：分离、半融合、全融合。分离和全融合的状态很容易理解，而半融合状态则是通过这样的实验设置验证得到的。 半融合状态通路 半融合状态通路（或称半分离路径hemi-fission pathway）指的是细胞膜与囊泡膜之间状态转变的过程，是一种时间上的变化，有多种组合形式，例如： （1）分离→全融合 细胞膜最简单的磷脂双分子层，行为复杂到超出你的想象（三） （2）分离→全融合→半融合 细胞膜最简单的磷脂双分子层，行为复杂到超出你的想象（三） （3）分离→全融合→半融合→分离 细胞膜最简单的磷脂双分子层，行为复杂到超出你的想象（三） （4）分离→全融合→半融合→全融合 细胞膜最简单的磷脂双分子层，行为复杂到超出你的想象（三） （5）分离→半融合→分离 细胞膜最简单的磷脂双分子层，行为复杂到超出你的想象（三） 也许，你也可以想到其他的组合形式，那么，用类似的实验同样能验证你想象中的组合是否存在。 状态转变与分子机制 细胞膜和囊泡膜在细胞中无时无刻不再上演着分离与融合的戏码，分分合合体现在二者进行分离、半融合和全融合的结构转变过程中。 细胞膜最简单的磷脂双分子层，行为复杂到超出你的想象（三） 分离可以变成半融合，半融合可以变成分离；半融合可以变成全融合，全融合可以变回半融合；实际上，分离和全融合之间也可以相互转变。 这也正是胞吞和胞吐的过程。从融合到分离，是胞吞的过程；从分离到融合，是胞吐的过程。 在这些转变过程中，有无数的蛋白分子在发挥作用。 例如，从分离到融合需要钙离子感受器（Calcium sensors）的参与以及SNARE复合体作为分子机器，拉近细胞膜与囊泡膜的之间的距离；从融合到分离需要网格蛋白（Clathrin）、吞蛋白（Endophilin）、动力蛋白（Dynamin）等几十种蛋白的默契配合。 不同蛋白在转变过程中的功能，是揭开胞吞、胞吐过程机制的关键，也是该领域内的热点。 总结 话说天下大事，合久必分，分久必合。细胞膜也是一样。胞吞是细胞膜一分为二，变成细胞膜和囊泡膜；胞吐是细胞膜和囊泡膜合二为一，变成细胞膜。 看似只是简单的磷脂双分子层结构，细胞膜却拥有多种复杂的行为，例如营养摄取、突触传递、病毒进入、激素分泌等。至今，科学家们对细胞膜功能的研究仍进行地如火如荼。 参考文献 Zhao WD, Hamid E, Shin W, et al. Hemi-fused structure mediates and controls fusion and fission in live cells. Nature. 2016;534(7608):548-552. doi:10.1038/nature18598 |
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