【原】原来RNA最怕忽冷忽热

昵称70100404 2020-07-29

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提取高质量的RNA几乎是每一位研究人员必备的实验技能，然而RNA是生物样品中最容易降解的成分。RNA完整性对于基因表达分析至关重要，降解产物的存在直接影响研究结果。影响RNA质量的因素除组织类型等不可控因素外，许多研究结果也已经找到了保护RNA不被降解以达到最佳保存的可控因子。对于富含RNA酶的组织，研究者应快速处理组织，并在操作过程处于低温和无RNA酶的环境，从而获得具完整性和稳定性的RNA。此外，反复冻融也会导致RNA的降解。一旦样品解冻，RNA降解的几率和风险就会增加，并可能导致错误的分析结果。

那么反复冻融对RNA完整性的影响究竟如何？小编带大家看看反复冻融对胃肠道癌及邻近的癌旁组织的影响。

北京大学Ying Hu等人曾发表文章：Influence of Freeze-Thaw Cycles on RNA Integrity of Gastrointestinal Cancer and Matched Adjacent Tissues。作者利用不同冻融次数的胃肠道癌及癌旁组织来检测RNA的完整性，不仅探讨了反复冻融对RNA完整性的影响，而且发现不同癌组织及癌旁组织对RNA的敏感性也存在很大差异。

摘要

通过对反复冻融胃肠道癌及癌旁组织RNA完整性的影响，以及不同组织样本对RNA的敏感性的不同，为样本的保存提供了理论依据。

结论

反复冻融会影响RNA的完整性。胰腺癌组织的RNA最敏感，而来自肝癌组织的RNA似乎不受反复冻融的影响。与癌症组织不同，所有类型的癌旁组织都容易降解。

实验方法

取样：样本来自五种常见的胃肠癌和邻近的癌旁组织，包括：胃（n = 24）；肝脏（n = 5）；结肠（n = 5）；直肠（n = 5）；胰腺（n = 7）

分组	冻融次数	具体操作	保存方法
FT0	无冻融	无	保存在RNAlater中
FT1	冻融一次	在-80℃冷冻30分钟，在室温下解冻10分钟	保存在RNAlater 中
FT2	反复冻融两次	方法同上重复两次	保存在RNAlater中
用TRIzol试剂提取每个样本中的总RNA，并用安捷伦生物分析仪评估RNA完整性（检测RIN值），同时用光学显微镜来评估组织组成和形态

结果讨论

作者的研究表明，反复冻融对不同类型胃肠癌和相邻癌旁组织RNA完整性都有影响。

从癌旁组织中提取的RNA比从癌组织中提取的RNA更容易降解。在FT0，1/7的胰腺癌组织和5/7的癌旁组织的RIN值<6，胰腺癌组织[PT]和胰腺癌旁组织[PA]的RIN值表明RNA完整性不合格。除胰腺组织外，从所有未经冻融(FT0)的其他组织中提取的RNA的完整性均为合格(RIN评分>6)。

在结果中，冻融确实影响了RNA的完整性。在FT1，7/24的胃癌和20/24的非癌胃组织、1/5的结肠癌和4/5的非癌结肠组织和5/5的非癌直肠组织RIN值不合格。同样，在FT2，9/24的胃癌组织和23/24的非癌胃组织也发现RIN值不合格。

反复冻融对不同类型样本均有不同程度的影响

有趣的是，不同组织样本对RNA敏感性存在较大差异：

反复冻融对肝癌组织RNA的完整性无明显影响。Kap M等人的研究也表明人的肝脏组织样本不易受冻融方式和冷冻运输的影响，但是在纱布运输和盐运输时，基因表达发生变化。

无论是新鲜的还是反复冻融的，RNA降解在胰腺癌组织中尤其显著。据报道，胰腺中含有大量的蛋白酶、DNA酶和RNA酶，它们能启动自溶过程（Griffin et al.，2012），而RNA降解可能与胰腺中含有丰富的RNA酶有关(Peracaula et al.，2000)。

部分从胃癌和结肠癌组织中提取的RNA在经历冻融后RIN值下降，这说明了适当保存样本的重要性。

在相同冻融条件不同组织样本的RNA完整性也呈现不同趋势

那么样本究竟应该如何制备，如何保存？

组织样本的如何制备和保存，嘉因给您建议

样本制备：

1.动物组织样本：活体取样，剔除结缔组织以及其它非研究组织，切成小块，分装至事先标记好的冻存管，液氮速冻。

2.冰冻植物组织：采集前用蒸馏水清洗表面泥土，吸干表面水分，目标组织切成小块，分装至事先标记好的离心管，液氮速冻。

样本保存：

制备好的样本-80℃保存，根据实验需要分管保存，避免样品反复冻融。

参考文献：

1. Kap M, Sieuwerts AM, Kubista M, Oomen M, Arshad S,Riegman P. The influence of tissue procurement procedures on RNA integrity, gene expression, and morphology in porcine and human liver tissue. Biopreserv Biobank 2015;13:200–206.

2. Griffin M, Abu-El-Haija M, Abu-El-Haija M, Rokhlina T, Uc A. Simplified and versatile method for isolation of high-quality RNA from pancreas. Biotechniques 2012;52:332–334.

3. Peracaula R, Cleary KR, Lorenzo J, de Llorens R, Frazier ML. Human pancreatic ribonuclease 1: Expression and distribution in pancreatic adenocarcinoma. Cancer 2000;89:1252–1258.