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酪氨酸激酶抑制剂（TKI）显著改善了慢性髓性白血病（CML）患者的预后，但仍有部分患者在TKI治疗过程中出现耐药。既往研究显示，接受伊马替尼治疗的CML患者中，1年内20%~30%患者发生耐药[1,2,3]。BCR-ABL激酶区突变是TKI耐药的主要机制之一，突变改变了BCR-ABL的构象，影响其与TKI结合，进而抑制TKI抗肿瘤效应。其中，T315I突变患者对一代TKI（伊马替尼）和二代TKI（尼洛替尼、达沙替尼）广泛耐药[4]。BCR-ABL激酶区突变是国内外专家公认选择TKI治疗CML患者时的重要参考[5,6]。国外已有多项研究报道TKI耐药CML患者BCR-ABL激酶区突变的类型[7,8,9,10]，国内也有研究报道中国TKI耐药CML患者的突变类型，但病例数相对较少[11,12,13]。为此，本研究中我们回顾性分析了自2001年6月至2019年9月于北京大学人民医院就诊并发生TKI耐药的CML患者，分析BCR-ABL激酶区突变在中国CML患者中的分布特征，并探究与BCR-ABL激酶区突变特别是T315I突变相关的因素。 病例与方法 1．病例： 回顾性收集2001年6月至2019年9月就诊于北京大学人民医院并发生TKI耐药的CML患者临床资料。CML的分期参考欧洲白血病网（European Leukemia Net, ELN）指南标准[5]。 2．TKI耐药： ①一线TKI耐药：采用ELN推荐中TKI作为一线治疗反应评估中的'治疗失败'标准：治疗3个月时未达完全血液学反应（CHR）或Ph 细胞比例>95%，治疗6个月时BCR-ABLIS>10%或Ph 细胞比例>35%，治疗12个月时BCR-ABLIS>1%或Ph 细胞比例>0，任何时间失去CHR、完全细胞遗传学反应（CCyR ，Ph 细胞为0）或主要分子学反应（MMR，BCR-ABLIS≤0.1%），出现新的BCR-ABL激酶区突变，进展至加速期或急变期，出现Ph 克隆演变（CCA/Ph ，Ph 细胞基础上的其他克隆性染色体异常）。②二线TKI耐药：治疗3个月时未达CHR或Ph 细胞比例>95%，治疗6个月时BCR-ABLIS>10%或Ph 细胞比例>65%，治疗12个月时BCR-ABLIS>10%或Ph 细胞比例>35%，任何时间失去CHR、部分细胞遗传学反应（PCyR，Ph 细胞比例1%~35%）、CCyR或MMR，出现新的BCR-ABL激酶区突变，进展至加速期或急变期，出现CCA/Ph 。③三线TKI耐药：目前国内外尚无统一的三线TKI耐药标准，本研究采用与二线TKI耐药相同的标准。④原发耐药：患者在治疗初期即对TKI缺乏血液学、细胞遗传学或分子学反应。⑤继发耐药：患者在获得一段时间、一定程度的治疗反应后再次丧失反应。⑥TKI耐药次数：同一患者先后服用多种TKI，每发生一种TKI耐药记为一次TKI耐药。⑦BAR-ABL突变：同一患者先后发生多次TKI耐药，每次TKI耐药时检出新的BCR-ABL突变类型记为服用该TKI时检出的BCR-ABL突变。 3．BCR-ABL激酶区突变分析： 采用红细胞裂解法获得CML患者骨髓或外周血中有核细胞，采用TRIzol法提取总RNA。总RNA经逆转录酶逆转录成cDNA[14]，按既往报道的方法采用巢式PCR进行ABL激酶区扩增，PCR终产物为863 bp，对应ABL蛋白的第219~506氨基酸[11]。将PCR测序结果与野生型ABL基因（美国GeneBank X16416.1）进行序列比对，确定突变类型。 4．统计学处理： 连续变量通过ROC曲线确定影响突变的界值。患者疾病特征采用描述性统计分析，组间比较采用Person卡方检验。将单因素分析中P<0.2的因素纳入二元Logistic回归模型进行多因素分析，P<0.05为差异有统计学意义。采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。 结果 一、患者临床特征 本研究纳入804例CML患者，共发生1 093例次TKI耐药，其中对伊马替尼、尼洛替尼和达沙替尼耐药分别为576（52.7%）、238（21.8%）和279例次（25.5%）。男性710例次（65.0%），中位年龄38（4~83）岁，468例次（42.8%）合并其他疾病，162例次（14.8%）在开始服用当前TKI时为进展期（加速期或急变期），479例次（43.8%）曾有TKI减停用药史。554例次（50.7%）为TKI原发耐药。对当前TKI耐药时，有182（16.7%）、104（9.5%）、518（47.4%）和200例次（18.3%）分别处于进展期、血液学耐药（慢性期、但丧失或未达CHR）、细胞遗传学耐药和分子学耐药。804例患者中，检测T315I突变时所服用的TKI（一次或多次BCR-ABL突变检测均未检出突变者记首次检测时所服用的TKI，检出非T315I突变者记首次检出该突变时所服用的TKI，检出T315I突变者记首次检出T315I突变时所服用的TKI）分别为伊马替尼386例（48.0%），尼洛替尼182例（22.6%），达沙替尼236例（29.4%）；一代TKI 386例（48.0%），二代TKI 418例（52.0%）；一线TKI 423例（52.6%），二线TKI 273例（34.0%），三线及以上TKI 108例（13.4%）。对伊马替尼、尼洛替尼和达沙替尼耐药患者的临床特征详见表1。  点击查看表格 表1 804例酪氨酸激酶抑制剂（TKI）耐药慢性髓性白血病患者的临床特征 表1 804例酪氨酸激酶抑制剂（TKI）耐药慢性髓性白血病患者的临床特征 二、BCR-ABL激酶区突变类型 1．伊马替尼耐药： 576例次伊马替尼耐药中，291例次（50.5%）检出突变，其中54例次（9.4%）检出至少2种突变。在所有44种BCR-ABL突变类型中，T315I突变发生率最高，共71例次（12.3%），其次为Y253F/H（43例次，7.5%）、F359V/C/I（32例次，5.6%）（图1A）。P环突变共105例次（18.2%），包括Y253F/H（43例次，7.5%）、E255K/V（25例次，4.3%）、G250E（22例次，3.8%）、Q252H（8例次，1.4%）和L248V（7例次，1.2%）。  点击查看大图 图1 对伊马替尼（A）、尼洛替尼（B）和达沙替尼（C）耐药CML患者突变特征 图1 对伊马替尼（A）、尼洛替尼（B）和达沙替尼（C）耐药CML患者突变特征 2．尼洛替尼耐药： 238例次尼洛替尼耐药中，152例次（63.9%）检出突变，其中25例次（10.5%）检出至少2种突变。共检出18种突变类型，其中T315I突变发生率最高（65例次，27.3%），其次为F359V/C/I（29例次，12.2%）、Y253F/H（28例次，11.8%）和E255K/V（25例次，10.5%），发生率均>5%（图1B）。P环突变共62例次（26.1%），包括Y253F/H（28例次，11.8%）、E255K/V（25例次，10.5%）、G250E（8例次，3.4%）和Q252H（1例次，1.4%）。 3．达沙替尼耐药： 279例次达沙替尼耐药中，160例次（57.3%）检出突变，其中24例次（8.6%）检出至少2种突变。共检出19种突变类型，其中T315I突变发生率最高（95例次，34.1%），其次为F317L/V/I/C（32例次，11.5%）、E255K/V（15例次，5.4%），发生率均>5%（图1C）。P环突变共24例次（8.6%），包括E255K/V（15例次，5.4%）、G250E（5例次，1.8%）、Y253F/H（3例次，1.1%）和Q252H（1例次，0.4%）。 三、影响BCR-ABL激酶区突变的因素 将检出任意BCR-ABL突变作为终点，根据ROC曲线确定相应连续变量的界值如下：在伊马替尼、尼洛替尼、达沙替尼耐药患者中，年龄分别为46、30和49岁，诊断至服用当前TKI间隔分别为6、30和30个月，发生治疗失败至筛查突变间隔分别为6、0和1个月，治疗失败时当前TKI服用时间分别为8、7和15个月，治疗失败时总TKI服用时间分别为8、7和17个月。将检出T315I突变作为终点，根据ROC曲线确定相应连续变量的界值如下：年龄为49岁，诊断至服用当前TKI间隔为6个月，发生治疗失败至筛查突变间隔为0个月，治疗失败时当前TKI服用时间为47个月，治疗失败时总TKI服用时间为14个月。 在伊马替尼、尼洛替尼和达沙替尼耐药的CML患者中分别分析影响检出突变的因素，单因素分析纳入年龄、性别、共存疾病、开始服用当前TKI时分期、诊断至服用TKI间隔、诊断至服用当前TKI间隔、TKI减停用药史、耐药时当前TKI服用时间、耐药类型（原发耐药或继发耐药；耐药时处于进展期、血液学耐药、细胞遗传学耐药、分子学耐药）、发生治疗失败至筛查BCR-ABL突变间隔等因素。在所有TKI耐药CML患者中分析影响检出T315I突变的因素，单因素分析时，除上述因素外，还纳入了当前TKI种类（伊马替尼、尼洛替尼或达沙替尼；一代或二代；一线、二线或三线及以上）。单因素分析结果详见表2和表3。  点击查看表格 表2 影响酪氨酸激酶抑制剂（TKI）耐药慢性髓性白血病患者检出突变的单因素和多因素分析 表2 影响酪氨酸激酶抑制剂（TKI）耐药慢性髓性白血病患者检出突变的单因素和多因素分析 注：通过ROC曲线确定影响突变的界值：A：伊马替尼耐药46岁，尼洛替尼耐药30岁，达沙替尼耐药49岁；B：伊马替尼耐药6个月，尼洛替尼耐药30个月，达沙替尼耐药30个月；C：伊马替尼耐药6个月，尼洛替尼耐药0个月，达沙替尼耐药1个月；D：伊马替尼耐药8个月，尼洛替尼耐药7个月，达沙替尼耐药15个月；E：伊马替尼耐药8个月，尼洛替尼耐药7个月，达沙替尼耐药17个月  点击查看表格 表3 影响酪氨酸激酶抑制剂（TKI）耐药慢性髓性白血病患者检出T315I突变的单因素和多因素分析 表3 影响酪氨酸激酶抑制剂（TKI）耐药慢性髓性白血病患者检出T315I突变的单因素和多因素分析 在伊马替尼、尼洛替尼和达沙替尼耐药CML患者中分别分析影响BCR-ABL突变检出的因素，多因素分析结果如表2所示，TKI减停用药史是影响BCR-ABL突变检出的共同因素，因不良反应减停TKI的患者突变检出率均较无TKI减停用药史的患者更低。此外，男性、年龄小、无共存疾病、诊断至服用当前TKI间隔时间长、服用当前TKI时为进展期、继发耐药、耐药时处于进展期或血液学耐药和治疗失败时当前TKI服用时间长的患者突变检出率更高。发生治疗失败至筛查BCR-ABL突变时间间隔也与检出突变相关，在伊马替尼耐药CML患者中，间隔>6个月的患者突变检出率更高，而在达沙替尼耐药CML患者中，间隔≤1个月的患者突变检出率更高。 在所有CML患者中分析影响T315I突变检出的因素，多因素分析结果显示，男性（P=0.069）、诊断至首次服用TKI间隔>6个月、服用尼洛替尼或达沙替尼和继发耐药患者T315I突变检出率更高，因不良反应减停TKI和治疗失败时当前TKI服用时间>47个月（P=0.051）的患者T315I突变检出率更低（表3）。 讨论
我们的研究结果显示，伊马替尼、尼洛替尼和达沙替尼耐药CML患者BCR-ABL突变检出率分别为50.5%、63.9%和57.3%，其中T315I突变检出率均为最高，分别为12.3%、27.3%和34.1%。无TKI减停用药史是影响伊马替尼、尼洛替尼和达沙替尼耐药患者检出突变的共同因素。对T315I突变分析显示，男性、诊断至首次服用TKI间隔>6个月、服用尼洛替尼或达沙替尼和继发耐药患者T315I突变检出率更高，因不良反应减停TKI和治疗失败时当前TKI服用时间>47个月的患者T315I突变检出率更低。 既往研究发现，伊马替尼、尼洛替尼和达沙替尼耐药CML患者BCR-ABL突变检出率分别为12%~63%、24%~28%和14%~27%，其中多项研究中T315I突变检出率最高[15]。本研究中伊马替尼、尼洛替尼和达沙替尼耐药CML患者BCR-ABL突变检出率与既往研究报道一致。 本研究结果显示，伊马替尼、尼洛替尼或达沙替尼耐药的CML患者中，无TKI减停用药史患者突变检出率高于因不良反应减停TKI的患者。Vaidya等[16]发现BCR-ABL突变与TKI选择压力有关。因此，无TKI减停史患者突变检出率高可能与TKI压力性选择作用更强相关。 尼洛替尼耐药CML患者中，男性和年轻患者BCR-ABL突变检出率更高。Pagnano等[17]报道了一项多中心回顾性研究，TKI（包括伊马替尼、尼洛替尼和达沙替尼）耐药的CML患者中，检出突变患者较未检出突变患者中位年龄更小[49（15~89）岁对51（15~89）岁，P=0.01]，男性患者比例更高（64.1%对56.0%，P=0.08）。伊马替尼和达沙替尼耐药患者中，发生治疗失败至筛查突变间隔与突变检出率相关，伊马替尼耐药患者间隔越长（>6个月），突变检出率更高，而在达沙替尼耐药患者中，间隔越短（<1个月），突变检出率更高。这种差异可能是由于伊马替尼多作为一线治疗，而达沙替尼则多作为二线或三线治疗。 我们的研究结果显示，诊断至服用当前TKI间隔长、耐药时处于进展期或血液学耐药、继发耐药与BCR-ABL突变检出率更高相关，与多项研究结果一致[8, 10,11]。 对影响T315I突变的因素分析显示，尼洛替尼和达沙替尼耐药的CML患者较伊马替尼耐药患者T315I突变发生率更高，这可能是由于尼洛替尼和达沙替尼更多作为二线或三线治疗，尤其达沙替尼在国内尚未批准作为一线治疗。DASISION研究两年随访结果显示，达沙替尼组发生BCR-ABL突变的患者中，T315I突变占70%（7/10），而伊马替尼组发生BCR-ABL突变的患者中无T315I突变[18]。Branford等[19]报道在伊马替尼耐药患者中，治疗失败时加速期或急变期患者较慢性期患者T315I突变检出率更高。本研究未得到类似结果，可能是由于本研究中CML患者服用的TKI除伊马替尼外，还包括尼洛替尼和达沙替尼。 本研究不足之处包括：①非前瞻性、随机研究；②并非所有患者均规律监测了血液学、细胞遗传学和分子学反应，一定程度上干扰了耐药准确时间、耐药类型和突变检出时间的判断。 总之，我们的研究结果显示，伊马替尼、尼洛替尼和达沙替尼耐药的CML患者，半数以上均检测出BCR-ABL突变，其中T315I突变比例均为最高，人口学、疾病状态和TKI用药等临床特征与BCR-ABL突变的检出率和类型显著相关。 |
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