一、慢病毒 逆转录病毒(Retrovirus):是一种RNA病毒,在复制时需在逆转录酶的作用下首先将RNA转变为cDNA, 再在DNA复制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增。主要包括RNA肿瘤病毒、慢病毒及泡沫病毒等三种亚科。 慢病毒(Lentivirus):属于逆转录病毒科,名称源自该种病毒长达数年的潜伏期。 最经典的慢病毒是由HIV病毒改造而来,而且HIV-1/HIV-2系统也得到了广泛的应用,除了HIV病毒系统以外,后续还有猿类免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus, SIV)载体系统、猫免疫缺陷病毒(felines immunodeficiency virus, FIV)载体系统、绵羊梅迪-维斯纳病毒(MMV)载体系统和马传染性贫血(EIA)载体系统等。 慢病毒结构: 2个调节基因: (1)tat基因:反式激活因子,对HIV基因起正调控作用。 (2)rev基因:病毒蛋白表达调节因子,增加gag和env基因对结构蛋白的表达。 4个辅助蛋白(附属)基因: (1)vif和vpu调节感染性病毒颗粒的产生; (2)vpr和nef参与疾病的表现。 慢病毒的优势: 1.慢病毒携带的基因组可整合到宿主基因组,使宿主细胞长时间稳定表达外源基因; 2.可感染分裂和非分裂细胞; 3.低免疫原性,直接注射活体组织不易造成免疫反应,适用于动物实验; 4.可以更换特异性启动子; 5.野生型的HIV大小约为9.8 kb,插入片段可长达5-6 kb; 二、慢病毒载体 慢病毒载体(Lentivirus)是一类改造自人免疫缺陷病毒(HIV)的病毒载体,是逆转录病毒的一种,基因组是RNA,其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代,属于假型病毒。可利用逆转录酶将外源基因整合到基因组中实现稳定表达,具有感染分裂期与非分裂期细胞的特性。 慢病毒包装过程: 慢病毒基因组进入细胞后,在细胞浆中反转录为DNA,形成DNA整合前复合体,进入细胞核后,DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录成mRNA,回到细胞浆中,表达目的蛋白;或产生小RNA。慢病毒介导的基因表达或小RNA干扰作用持续且稳定,并随细胞基因组的分裂而分裂。 慢病毒包装和侵染细胞的过程(元和生物) 三、慢病毒的使用和优势 慢病毒的使用量的取决因素:滴度, 感染体积 ,MOI ,细胞密度 滴度(Titer):单位体积液体中有感染能力的病毒或噬菌体数目。单位:TU/mL (活性滴度单位)、copies/mL (物理滴度单位) 检测方法:定量PCR检测干扰后细胞基因组中外源DNA拷贝数。 实验原理:慢病毒介导外源基因以逆转录方式整合进目的细胞基因组。 MOI(multiplicity of infection):感染复数或者复感染指数。指感染时病毒和细胞数量的比值。在实验中也将某个细胞达到 80%感染时所需的MOI 值定义为这个细胞的MOI值。加的病毒量(μl)=细胞数×MOI/滴度(…/ml) ×1000。 最后,818 一些有关慢病毒方面... 1.关于慢病毒载体构建方面: ORF表达克隆【LPP系列,ORF/Promoter/lncRNA慢病毒】 shRNA克隆【LPP系列,shRNA慢病毒】 miRNA克隆【LPP系列,miRNA/inhibitor慢病毒】 Cas 9 和sgRNA克隆【系列,Cas9 慢病毒】 2.慢病毒包装服务方面(慢病毒颗粒,病毒浓缩,包装细胞系等) LT001,基于HIV骨架的慢病毒颗粒包装试剂 (20 reactions) LT005,基于qRT-PCR技术的HIV骨架慢病毒颗粒滴度检测试剂 (20次RT反应 +50次PCR反应) LT007,慢病毒浓缩试剂盒(50 ml) LT008,293Ta慢病毒颗粒包装细胞系 (1.5 x 106 cells) |
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