【原】【材料】JACS：用于单分子荧光成像的自修复染料

CBG资讯公众号 2020-08-19

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荧光显微成像技术因具有无伤、高精度等特性在生命科学领域有着无可替代的地位，单分子荧光成像技术及超分辨荧光显微技术的发展更是让这类技术的地位不可动摇。作为荧光成像的核心，荧光染料的重要性不言而喻，而在众多荧光染料的性质中，染料的稳定性一直是研究人员最为关心的问题。通常，单独的荧光染料并不能在复杂的环境中长时间、稳定地发光，因此研究人员通过加入一定量的光稳定剂来提升染料的稳定性。这些光稳定剂可以猝灭染料分解过程中产生的不稳定中间体。然而，如果需要达到理想的稳定效果，光稳定剂的浓度必须比较高，而这对系统的正常运行可能会造成一定的影响。因此，研究人员开发了一类“自修复”染料：通过将稳定剂直接连接到染料上来间接提高稳定剂的浓度从而实现染料的稳定性。常用的光稳定剂通常是一些有机小分子，如三线态能量受体类分子环辛四烯（COT）以及电子供体/受体类分子水溶性维生素E（Trolox）、硝基苯甲醇（NBA）和硝基苯丙氨酸（NPA）。

图1. trisNTA（a）、Alexa 647（b）及链接分子（c）的结构式

（来源：J. Am. Chem. Soc.）

近日，加拿大麦吉尔大学的Gonzalo Cosa和德国法兰克福大学的Robert Tampé联手报道了一种基于镍的光稳定剂，其不仅能提高染料母体的光稳定性，还能赋予染料特殊的标记能力。该课题组之前报道过镍离子能有效稳定Cy5、Alexa Fluor 647、ATTO647N、Cy3、ATTO532、Alexa532等多种染料，但是潜在的细胞毒性及较低的多肽亲和性一直限制着镍离子光稳定剂的发展。在本项研究中，作者通过镍与次氮基三乙酸（NTA）配位的trisNTA将镍离子链接到染料分子Alexa647上（图1），这种策略不仅能有效地稳定染料母体，而且能降低镍离子的毒性。此外，通过该策略修饰的染料还可以与含有多聚组氨酸标签（His_6-10 tag）的生物分子进行选择性结合。相关研究成果以“TrisNTA Fluorophore as a Self-Healing Dye for Single-Molecule Fluorescence Imaging”为题发表于《美国化学会志》（DOI: 10.1021/jacs.8b04681）。

图2. 染料的单分子荧光成像研究示意图（a），平均存活时间（b）及平均发射光子数（c）

（来源：J. Am. Chem. Soc.）

为了对染料的光物理性质进行研究，作者通过自下而上的自组装方法将染料固定在玻璃基底上。首先，作者使用常规的方法在玻璃表面附上一层聚乙二醇（PEG），其中，约有1%的聚乙二醇是含有生物素的；接着，通过生物素与蛋白质的相互作用将含有His₆-tag的蛋白质附着在聚乙二醇层上；最后，将His₆-Tag与染料上的trisNTA结合从而把染料固定在玻璃上。在准备好染料后，作者利用635 nm波长的激光对染料进行照射并通过电子倍增电荷耦合器件（EMCCD）收集多个分子的荧光信息（图2a）。结果表明，直接和光稳定剂相连的染料trisNTA-Alexa647的平均存活时间高达259 s（图2b），比单纯的Alexa647（11.3 s）高出20多倍。此外，与Alexa647相比，trisNTA-Alexa647的平均发射光子数也有约15倍的提升。

图3. 几种不同染料结构的平均存活时间（a）、平均荧光强度（b）及发射光子数（c）

（来源：J. Am. Chem. Soc.）

虽然trisNTA-Alexa647比单纯的染料具有更高的光稳定性，但是作者发现光稳定剂（镍离子）的修饰会使得Alexa647的亮度有所降低，而游离的镍离子却可以大幅度增加染料的亮度。作者推测其原因与稳定剂离染料母体的距离远近有关。镍离子作为光稳定剂，可以有效地对染料三线态进行猝灭（增加染料的光稳定性）。但是作者发现，镍离子还会对染料单线态进行猝灭（降低染料的亮度）。因此，镍离子与染料母体的距离太近时，染料的光稳定性会增加但亮度有所降低；距离较远时，对亮度影响不大但会降低稳定效果。所以，作者希望在这两者中选取一个平衡点，于是作者制备了含有不同长度链接基团的染料，并对它们的光物理性质进行了测试（图3），通过对比链接基团长度对染料光稳定性及发光特性的影响，作者认为具有4个脯氨酸长度链接基团的染料trisNTA-Pro₄-Alexa647最适合进行单分子荧光成像，实验结果支持了这一观点（图4）。