抗病毒多肽药物的研究进展

摘要：目前临床上有多种抗病毒药物，但是大部分病毒感染仍然无法完全治愈。最早在先天免疫系统中发现多肽可以抵御微生物感染。近年来在动物、植物、微生物体内相继发现了大量的抗菌肽和抗病毒肽。常见的抗菌肽大都具有广谱抗菌活性，通过破坏细菌的细胞膜，导致内容物泄露来发挥抑菌作用。另外，多肽也可通过抑制病毒侵入、病毒蛋白合成以及提高宿主免疫功能等方面来发挥抗病毒效应，为抗病毒药物的研发提供了新的来源。多肽的疏水性、电荷量、两亲性和分子质量主要影响多肽的成药性，而合适的多肽药物还应具有低毒性和高选择性的特征。文章综述了近年来研究的具有抑制单纯疱疹病毒( HSV) 、人类免疫缺陷病毒( HIV) 、甲型流感病毒( IVA) 和丙型肝炎病毒( HCV) 活性的多肽分子药物，并阐明其抗病毒活性和机理，可为抗病毒多肽药物的研究提供新思路。

病毒感染是一类严重威胁人类健康的疾病，大部分病毒易传染和易突变，使得人类对病毒感染的治愈变得更加困难。多年来，核苷类抗病毒药物的持续使用导致了耐药病毒株的出现，该类药物严重的毒副作用也限制了其临床应用。多肽含10～100个氨基酸残基，曾经在先天性免疫系统中被发现具有抵御微生物感染的功能。近年来，在动物、植物、微生物体内又相继发现了大量具有抗细菌、抗病毒、抗肿瘤活性的多肽。多肽相比传统药物具有活性高、不容易产生耐药等优点而被广泛研究，然而多肽本身存在制备成本高，稳定性差，来源有限等缺点。抗病毒药物主要可分为核苷类似物、蛋白酶抑制剂、免疫调节剂分别通过抑制病毒复制、感染、增强机体免疫力等方面来治疗病毒感染。目前上市的抗病毒多肽药物主要有 HIV 融合抑制剂恩夫韦地和免疫调节剂胸腺肽。然而到目前为止，多肽较少运用于抗病毒临床治疗。长期研究发现多肽的二级结构是发挥功能的关键，抗病毒多肽主要由 α-螺旋和 β-折叠结构的阳离子多肽组成，而多肽的分子质量、电荷量、两亲性和血清

稳定性决定了多肽的成药性。在此，我们探讨目前发现的抗病毒多肽的结构和机理为以后的多肽药物的设计提供理论基础(表1) 。

1 抗单纯疱疹病毒多肽

单纯疱疹病毒( Herpes simplex virus，HSV) 是一种人体常见的病原微生物，分为Ⅰ型单纯疱疹病毒( Herpes simplex virus-1，HSV-1) 和Ⅱ型单纯疱疹病毒( Herpes simplex virus- 2，HSV-2)，分别可引起口腔、生殖器的皮肤粘膜病变。HSV还是一种嗜神经和神经侵入性病毒，能够避开免疫系统并长期驻留在人体神经细胞内造成反复发作。目前抗病毒治疗具体 靶 向 于 病 毒 的 复 制 过 程，临床用药以阿昔洛韦( ACV) 和 ACV 样核苷类似物为主，但目前已经产生耐药现象，亟需开发新的抗 HSV 药物。抗 HSV 多肽可以通过抑制病毒吸附融合、破坏病毒包膜、调节机体的免疫功能来抑制病毒感染( 图 1) 。

1.1 抑制单纯疱疹病毒吸附和融合

防御素是一个 15 ～ 20 个氨基酸残基的多肽家族，基于二硫键的模式可分为 3 种亚型: α-防御素、β-防御素和 θ-防御素。α-防御素广泛靶向于多种病毒表面的糖蛋白并阻止病毒与细胞的融合。θ-防御素对 HSV-2 表面的糖蛋白 B有很高的结合能力，从而阻止病毒对细胞的侵染。贻贝抗菌肽( Mytilin-A) 是从紫贝中分离的一种含 34 个氨基酸残基的多肽，用预防法对细胞模型处理后，发现能完全抑制

HSV 的复制，表明该肽可能与细胞表面的受体相结合，抑制病毒的吸附。乳铁蛋白肽( Lactoferricin)  是从牛奶中分离的一种含有 25 个氨基酸残基的多肽，具有广泛的抗菌和免疫调节活性，还能通过结合到细胞表面的硫酸乙酰肝素受体阻止病毒与细胞的结合。抑制病毒吸附与融合的多肽主要是一类阳离子多肽，通过静电作用结合到病毒表面的糖蛋白或细胞表面的受体，从而阻止病毒与细胞的融合。

1.2 破坏单纯疱疹病毒包膜

β-防御素对包膜病毒如单纯疱疹病毒，免疫缺陷病毒，水泡性口炎病毒、流感病毒、巨细胞病毒等包膜病毒具有广泛的抑制活性，其机制是直接导致病毒颗粒的失活。鲎肽素( Tachyplesin，TP)是一种存在于鲎血细胞中的多肽。 TP 在水溶液中形成两亲性的 β-片状结构，能够直接结合并破坏脂质双分子层，研究发现 TP 能有效抑制多种病毒的复制，对 HSV-2 的抑制效果尤其明显。对虾素( Penaeidins)是一个从几种虾类中分离得到的含有 47 ～ 62 残基的多肽家族。Penaeidin-3 是从凡纳滨对虾中分离的一种有 62 个氨基酸残基的多肽，含有 3 对二硫键，这种二硫键提高了肽的两亲性。当 Penaeidin-3 和 HSV-1 同时加入细胞时，对病毒表现出明显的抑制活性。蜂毒肽( Melittin) 是一个由 26 个氨基酸残基组成的多肽，是蜂毒的主要成分，在较低浓 度 下 对 HSV-1、HSV-2 和 HIV-1 具有明显抑制活性。机理研究表明，蜂毒肽能通过破坏病毒的包膜而直接灭活病毒。然而，这类多肽的活性主要依赖于破坏病毒表面的脂质双分子层，由于特异性不强，溶血毒性太大，不太可能发展成为抗病毒药物。

1.3 针对宿主细胞的免疫调节

除了针对病毒颗粒或病毒附着和进入机制，人体的先天免疫系统也是抗病毒药物设计的有效靶点。胸腺肽是从小牛胸腺组织提取的具有生理活性的一组多肽。胸腺肽中包含多种激素，主要活性成份是一种由 28 个氨基酸组成的多肽，共同诱导 T 细胞的成熟分化，用于治疗慢性肝炎、疱疹病毒感染等免疫功能低下的疾病。

2 抗人类免疫缺陷病毒多肽

艾滋病又称获得性免疫缺陷综合症( Acquired immune deficiency syndrome，AIDS) ，是由人类免疫缺陷病毒Ⅰ型 ( HIV-1) 感染人体 CD4 + 淋巴细胞所导致的疾病，患者由于免疫功能下降，容易产生机会性感染、皮肤感染、肿瘤和各种各样的疑难杂症或并发症。抗 HIV 多肽可通过抑制病毒吸附融合，抑制整合酶活性，破坏病毒包膜来发挥功效。

2.1 抑制人类免疫缺陷病毒吸附和融合

HIV-1 进入靶细胞需要经历 3 个步骤: 首先，病毒表面的糖蛋白 gp120 与宿主细胞表面 CD4 受体相结合，使病毒附着到细胞上; 然后，gp120 与宿主细胞的复合受体 CXCＲ4 或 CCＲ5 反应; 最后，HIV-1 的跨膜亚基 Gp41 的构象发生改变，激活融合肽，进而使病毒外壳与宿主细胞膜融合，导致病毒 ＲNA 进入宿主细胞质中。因此病毒表面蛋白 Gp41、 gp120 和宿主细胞受体 CXCＲ4、CCＲ5 都可作为抗 HIV 药物设计的有效靶点。

恩夫韦地( T20) 是经美国 FDA 批准的第一个多肽类HIV 融合抑制剂，然而，因其效价低、易引起耐药性、半衰期短而在临床应用中受限。近年来，中国研发了西夫韦肽( Sifuvirtide) 用于治疗 T20 耐药病毒感染，该肽是一段改造的含口袋结合域( Pocket binding domain) 的 Gp41C-末端区域( CHＲ) ，对实验室适应株和临床分离株具有广泛和高效的抑制能力，且比 T20 具有更长的半衰期。TLT35是 在 HIV-1 Gp41 抑制剂的基础上设计的一种融合蛋白，由一个可伸缩的 35 聚体连接 T1144 和 T20 而成。TLT35 对不

同的 HIV-1 株和 T20 耐药株有着较强的抑制活性，还能抑制 HIV-1 介导的细胞-细胞融合。TLT35 约含 110 氨基酸序列，适合在大肠杆菌中重组表达，并通过发酵培养大规模生产。Fb006是根据 Gp41 设计的一种多肽，用马来酰胺丙酸( 3-maleimidoproionicAcid，MPA) 修饰后称为 Albuvirtide。 Fb006( IC50 : 1. 4 nm) 和 Albuvirtide( IC50 : 1. 9 nm) 具有相似的抑制活性，但是 Albuvirtide 能在静脉注射后迅速与血清白蛋白( 摩尔比为 1∶ 1) 结合形成偶联物，从而显著延长了半衰期。该药目前已经通过了第Ⅰ期和第Ⅱ期临床试验。这类多肽药物目前已经取得了惊人的进展，在第一代融合抑制剂的基础上已经开发了第二代、第三代以 Gp41 为靶点的抑制 HIV 吸附融合的多肽药物。

2.2 抑制人类免疫缺陷病毒整合酶活性

宿主细胞内的病毒基因组需通过逆转录形成 DNA，然后转运到宿主核内并通过整合酶将其整合到宿主基因组上，从而与宿主细胞一起复制。因此，抑制整合酶的活性可以达到抑制 HIV 复制的目的。

Soultrait等使用酵母双杂交系统，以酵母基因组文库为多肽来源，筛选出了一种多肽 I33。I33 能在体外抑制整合酶的 3'端处理活性和链转移功能。进一步分析发现 I33 的 N-端片段 EBＲ28 呈 α-亲水性能螺旋构象，能够结合到整合酶的催化结构域，干扰酶与 DNA 底物的结合。EBＲ28 在细胞模型上有显著的抗病毒作用。Maes 等根据整合酶

二聚化的结合区域设计了几种多肽。发现来自病毒 CCD蛋白的 α1 和 α5 螺旋区多肽 INH1 和 INH5 能结合到整合酶表面并抑制酶的活性，在细胞模型上的能有效抑制病毒的整合作用。这类多肽需要进入细胞核发挥作用，往往由于亲和力较低，不能有效到达靶点发挥功能而不能发展成高效的抑制剂。

2.3 破坏人类免疫缺陷病毒包膜

Indolicidin 是一个从牛的中性粒细胞中分离的一种多肽，具有强效广谱的杀菌活性。Ｒobinson 等发现 Indo- licidin 可 以 有 效 抑 制 HIV-1 等包膜病毒的复制，在 333 μg /mL 37 ℃ 5 min 内能杀死超过 50% 的病毒。两栖动物为抗菌肽提供了丰富的来源，其中一些多肽具有抗病毒活性。Vancompernolle 等发现了来自两栖类动物的多肽Caerin 1. 1，Caerin 1. 9 和 Maculatin 1. 1 能抑制一系列包膜病毒。病毒与多肽共孵育后发现这些肽在无细胞毒性浓度下能抑制 HIV 感染细胞并且破坏病毒包膜。除此以外，这些多肽也能有效地抑制树突状细胞( Dendritic cells，DCs) 内 的 HIV 对 T 细胞的感染，这些研究表明，源于两栖动物的多肽可以作为粘膜表面抑制艾滋病毒的局部消毒剂。

3 抗甲型流感病毒多肽

流行性感冒是由流感病毒( Influenza virus) 引起的有发热特征的急性呼吸道疾病，可分为甲、乙、丙 3 种亚型，目前流行的不同亚型和日益增加的耐药株对人类健康造成严重威胁。抗甲型流感病毒( Influenza virus A，IVA) 多肽主要分为 3 大类，首先是流感病毒侵入阻断肽，如与流感病毒血凝素相互作用的 Flupep，阻断病毒与宿主细胞结合并阻止膜融合; 其次，一些肽可以破坏病毒包膜进而灭活病毒，如蜂

毒肽; 还有一些多肽可以抑制流感病毒复制，如 PB1 的衍生多肽。

3.1 抑制甲型流感病毒吸附和融合Flupep 是一类疏水性 α-螺旋多肽，能与病毒表面的血凝素 ( Hemaglutinin，HA) 结合阻断病毒融合。在 狗 肾( Madin-Darby canine kidney，MDCK) 细胞模型上，Flupep能在纳摩尔浓度抑制甲型流感病毒的复制。另外一类是修饰后的多肽，如利用烷基化技术修饰得的多肽 C17 H35 CO- AＲLPＲTMVHPKPAQP，通过模拟对接证明了该肽类似于HA 受体从而结合到细胞表面的唾液酸上，氨基末端的烷基链能引导 肽 组 装 形 成 胶 束 从 而 保 持 肽 的 稳 定 性。Huttl 等介绍了用棕榈酸修饰的多肽( C16-AＲLPＲTMVHPK- PAQP、C16-AＲLPＲTMV 和 C16-AＲLPＲ) ，由于形成了胶束结构，相比于未改造的线性肽，该肽与 HA 的结合力明显提高。尽管这类多肽与 HA 结合的机理并不明确，但是这种多肽的修饰方法，解决了多肽在体内运输中稳定性差的问题，提高了多肽类药物的成药性。

3.2 破坏甲型流感病毒包膜

病毒包膜来源于宿主细胞膜，含有脂筏、鞘脂和胆固醇等成分。这些物质具有两亲性，并携带负电荷，这会导致与阳离子多肽发生静电作用。一般来说，多肽与病毒膜的结合是通过静电作用介导的，而病毒包膜来源于宿主细胞，因此不像细菌膜表现出强烈的电负性，可能在抗病毒方面会具有较低的特异性。Cathelicidin /LL-37是一种人类抗病毒肽，能够抑制病毒复制并引发一系列机体保护机制。LL- 37 大量存在于中性粒细胞中，当有病原体急性反应时它也在上皮细胞中大量合成。机理研究发现 LL-37 既能结合并破坏病毒包膜，还能与细胞表面的唾液酸受体相结合来抑制病毒感染。

3.3 抑制甲型流感病毒复制

ＲNA 聚合酶是流感病毒转录和复制过程中的一个限速酶，由 PB1，PB2 和 PA 3 个亚基组成。基于各亚基的结合作用，许多研究者开发了一系列 PB1 衍生肽来抑制聚合酶功能，Ghanem 等通过免疫沉淀法检测了病毒聚合酶亚基的相互作用并开发了多肽 PB11-25 和 PB1715-740，体外实验发现这两种多肽可以结合到 PA 亚基，干扰病毒的聚合酶活性而抑制流感病毒复制。在另一项研究中，Li 等发现了来源于流感病毒 H5N1 的多肽 PB1731-757能够抑制病毒聚合酶活性并抑制病毒复制。总之，很多研究表明 PB1 衍生肽可以干扰 PB1 的 C-末端( PB1676-757 ) 和 PB2 的 N-末 端( PB21-40 ) 的相互作用。

4 抗丙型肝炎病毒多肽

丙型肝炎病毒( Hepatitis C virus，HCV) 是一种直径小于 80 nm 的单股正链 ＲNA 球形包膜病毒，具有高度传染性，而且携带时间长，能引发肝硬化、肝癌等晚期肝病。聚乙二醇 IFN-α 与利巴韦林联用是目前治疗慢性 HCV 感染的标准疗法。美国和欧洲 FDA 已批准使用雷迪帕韦( Le- dipasvir) 和索非布韦( Sofosbuvir) 对丙型肝炎病毒感染病人进行治疗，但是，丙型肝炎的治愈依然存在着许多挑战。抗 HCV 多肽主要分为抑制病毒吸附融合多肽和破坏病毒包膜的多肽。

4.1 抑制丙型肝炎病毒吸附和融合

hEP是一种来源于人载脂蛋白 E( Apolipoproteins E， ApoE) 的多肽，该肽包含一个受体结合片段和脂质结合片段，体外研究发现 hEP 毒性低，稳定性好，在微摩尔浓度能阻断丙型肝炎病毒进入细胞。进一步研究发现 hEP 可以结合到 HCV 表面蛋白的 ApoE 受体结合域，从而阻断 HCV 与肝细胞的结合。C18是根据多肽与丙型肝炎病毒包膜蛋白 E2 结合能力从肽库中筛选出来的一个多肽。HCV 包膜蛋白 E2 是该病毒侵入细胞的关键蛋白，细胞实验确证了多肽 C18 可以在体外有效抑制 HCV 假病毒颗粒对肝细胞的感染。HCV 的侵入是一个复杂的过程，涉及到多个宿主因子，如 CD81、Scavenger receptor BI、Claudin-1 ( CLDN1 ) 和 Occludin。CL58是从上述的 4 种宿主因子的交叉片段多肽库中筛选出一个多肽，含有 18 个氨基酸残基。该肽来自细胞内的 CLDN1 的第一跨膜区，能抑制 HCV 对肝细胞的

侵染。机理研究发现，C158 的抑制作用发生在病毒进入的较晚阶段，很可能在病毒与细胞结合以后。

4.2 破坏丙型肝炎病毒包膜

H2-3 肽是基于 HCV 膜表面的 P7 蛋白的结构特点设计的一种多肽。该肽是 HCV 的 P7 离子通道 H2 螺旋区的一个片段，在研究中发现 H2-3 毒性低、稳定性高，能有效抑制初始 HCV 感染。机理研究表明，H2-3 可以灭活胞内胞外的 HCV，此外还能结合到细胞膜而保护宿主细胞免受病毒感染。从蝎子的毒腺 cDNA 文库中筛选出一种α-螺旋 肽，Hp1090。该肽呈现一种两亲性 α-螺 旋 结构，在 5 μmol /L 时就能有效抑制 HCV 感染，机理研究发现，该肽与 HCV 颗粒表面的磷脂膜迅速结合并破坏脂质双分 子 层 结 构。因 此，这一类多肽可以开发为体外抗HCV 消毒剂。

5 展望

目前，临床上使用的抗病毒药物主要是靶向于病毒感染和复制的蛋白酶抑制剂和核苷类似物，在长期的使用中已经产生了耐药现象。抑制病毒吸附融合的多肽是一类非常有潜力的抗病毒药物，可以通过抑制病毒表面的蛋白酶活性来抑制病毒的侵入，一系列 HIV 吸附融合抑制肽已经

被开发成临床药物。破坏病毒包膜的多肽由于具有溶血毒性，一般不具成药性，可以开发成体外消毒剂。而免疫调节的多肽因来源较少，副作用多而受限。长期研究表明，多肽的二级结构是发挥抗病毒活性的关键，目前发现的抗病毒多肽主要是具有两亲性的 α-螺旋和 β-折叠结构的阳离子肽。该领域的研究将成为未来的热点。然而，抗病毒肽也面临一些亟待解决的问题，如容易在体内失活、合成费用昂贵、易受蛋白酶降解等。因此，开发性质稳定、分子质量更小靶向性高的多肽以及设计合适的给药途径等将成为未来抗病毒多肽研究的方向。

参考文献