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李春莲，周旭婕，娄培培，夏添松，石靓，王莹，丁强 南京医科大学第一附属医院乳腺外科 人表皮生长因子受体2（HER2）属于跨膜酪氨酸激酶受体家族成员，其家族包括表皮生长因子受体（EGFR）、HER2、HER-3和HER-4，家族中只有HER2没有相应的配体，通过与家族中的其他3个成员结合形成异源二聚体发挥生物学作用。HER2在20%～25%的乳腺癌中过表达，HER2过表达伴随乳腺癌的不良预后。曲妥珠单抗是目前广泛应用的针对HER2阳性乳腺癌的单克隆靶向治疗药物，也可以联合其他化疗药物用于乳腺癌的辅助治疗。曲妥珠单抗能够有效降低HER2阳性乳腺癌的复发和转移风险。然而，随着其临床应用经验的不断增加，曲妥珠单抗原发和继发性耐药已经成为重大的临床问题和研究热点。 RNA结合蛋白38也称RNPC1，定位于染色体20q13上，是RNA结合蛋白家族中的一员，分为RNPC1a和RNPC1b两种亚型，但主要是RNPC1a发挥生物学功能。RNPC1具有多种生物学功能，主要通过识别3'-端非编码区的富含AU元件区（ARE），在转录后水平对mRNA的稳定起着重要作用。本研究中，我们将外源性的RNPC1（特指RNPC1a）在BT474细胞中过表达，然后给予不同浓度的曲妥珠单抗处理，观察细胞生长抑制率和凋亡率的变化，探讨RNPC1过表达后，HER2阳性乳腺癌细胞对曲妥珠单抗敏感性的改变。 目的：探讨敲除和过表达外源性RNA结合蛋白38（RNPC1）基因后，人表皮生长因子受体2（HER2）阳性乳腺癌细胞对曲妥珠单抗敏感性的变化。 方法：采用慢病毒转染法敲除和过表达RNPC1基因，采用实时荧光定量PCR法检测各组BT474细胞中RNPC1和HER2mRNA的表达，蛋白质印迹法检测RNPC1和HER2蛋白以及PI3K/AKT蛋白的表达。以不同浓度的曲妥珠单抗处理各组BT474细胞，采用流式细胞术检测各组BT474细胞的凋亡率，细胞计数试剂盒8（CCK-8）法检测生长抑制率。以20μg/ml曲妥珠单抗处理各组BT474细胞，采用蛋白质印迹法检测各组BT474细胞中凋亡相关蛋白的表达。 结果：实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测结果均显示，RNPC1过表达后，RNPC1和HER2mRNA及蛋白的表达均增高；而敲除RNPC1基因后，RNPC1和HER2mRNA及蛋白的表达均降低。RNPC1的过表达能减少BT474细胞中p-PI3K和p-AKT蛋白的表达；RNPC1的敲除能增加p-PI3K和p-AKT蛋白的表达。5、10、15、20和25μg/ml曲妥珠单抗处理敲除实验组BT474细胞48h后的生长抑制率分别为（9.67±1.18）%、（21.67±1.23）%、（30.33±1.25）%、（40.33±1.69）%和（53.00±1.63）%，均明显低于相应浓度曲妥珠单抗处理的敲除对照组，分别为（14.00±0.82）%、（27.67±1.25）%、（39.67±1.79）%、（53.67±1.50）%和（63.33±1.52）%，均P＜0.05。5、10、15、20和25μg/ml曲妥珠单抗处理过表达实验组BT474细胞48h后的生长抑制率分别为（20.33±1.25）%、（35.38±2.05）%、（50.43±2.12）%、（65.35±2.08）%和（76.00±2.16）%，均明显高于相应浓度曲妥珠单抗处理的过表达对照组，分别为（13.67±1.24）%、（27.86±2.05）%、（39.72±1.69）%、（53.33±1.70）%和（62.68±2.07）%，均P＜0.05。10、20和30μg/ml曲妥珠单抗处理敲除实验组BT474细胞48h后的凋亡率分别为（11.64±0.68）%、（16.60±1.01）%和（25.14±3.12）%，均明显低于相应浓度曲妥珠单抗处理的敲除对照组，分别为（14.71±0.61）%、（22.65±0.96）%和（39.03±0.85）%，均P＜0.05。10、20和30μg/ml曲妥珠单抗处理过表达实验组BT474细胞48h后的凋亡率分别为（19.46±1.06）%、（30.87±0.98）%和（50.45±1.13）%，均明显高于相应浓度曲妥珠单抗处理的过表达对照组，分别为（14.38±0.64）%、（21.65±1.24）%和（38.03±0.85），均P＜0.05。RNPC1的过表达能增加BT474细胞中促凋亡蛋白Bim和Bad的表达，降低抑凋亡蛋白Bcl-xl的表达；RNPC1的敲除能减少Bim和Bad蛋白的表达，增加Bcl-xl蛋白的表达。 结论：RNPC1可以通过增加BT474乳腺癌细胞中HER2的表达，诱导乳腺癌细胞对曲妥珠单抗的敏感性。 曲妥珠单抗是一种人源性的免疫球蛋白G单克隆抗体，其治疗HER2阳性乳腺癌的机制可能是结合HER2的胞膜外结构Ⅳ区域，解除HER2和HER-3形成的二聚体结构，抑制下游通路PI3K/AKT和MAPK/ERK的活性，进而抑制细胞的增殖。然而临床上有近50%的乳腺癌患者对曲妥珠单抗的敏感性较低，有些患者最初使用曲妥珠单抗时即产生了耐药，很多患者在使用1年内发生耐药。目前，对曲妥珠单抗原发和继发耐药的机制研究才刚刚开始，其耐药机制可能为：（1）络氨酸激酶受体的相互作用和其他通路的异常激活；（2）PI3K/AKT通路的异常激活和PTEN的丢失；（3）HER2胞外受体的改变和减少，使曲妥珠单抗无法结合相应的区域发挥作用。 RNPC1是一种RNA结合蛋白，参与RNA剪接、多聚腺苷化作用、序列编辑、RNA转运、维持RNA的稳定和降解、细胞内定位和翻译控制等。RNPC1在乳腺癌中是一个抑癌基因，可以抑制乳腺癌细胞的生长和分化。RNPC1能够结合雌激素受体α（ERα）的3'-端非编码区，增加ERαmRNA的稳定性。 本研究中，我们使HER2阳性的BT474细胞过表达RNPC1，实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测结果显示，随着外源性RNPC1表达的增加，HER2mRNA和蛋白的表达水平也相应的增加；相反，敲除RNPC1的表达后，HER2mRNA和蛋白的表达也随之降低。RNPC1影响HER2表达的具体机制尚不清楚。有研究显示，RNPC1可以结合ERαmRNA，增加其稳定性。我们推测，RNPC1可能结合HER2mRNA，发挥类似的作用。另外，有研究显示，HER2的减少会增加曲妥珠单抗的耐药。因此，我们进一步探讨了RNPC1是否通过改变HER2的表达来影响乳腺癌细胞BT474对曲妥珠单抗的敏感性。 我们在RNPC1过表达和敲除的BT474细胞中分别加入不同浓度的曲妥珠单抗，过表达实验组BT474细胞的生长抑制率和凋亡率均明显高于过表达对照组，而敲除实验组BT474细胞的生长抑制率和凋亡率均低于敲除对照组。在凋亡相关蛋白表达的研究中，我们发现，RNPC1的过表达能增加促凋亡蛋白的表达，而减少抑凋亡蛋白的表达。这一结果表明，RNPC1过表达可以增加曲妥珠单抗的敏感性。其机制可能是RNPC1增加了HER2的表达，进而增加了曲妥珠单抗结合HER2胞外受体区域的可能。另一方面，本研究结果还证实，RNPC1可抑制HER2下游PI3K/AKT通路，更进一步说明RNPC1可以降低曲妥珠单抗的耐药。 综上所述，RNPC1可以通过增加乳腺癌BT474细胞中HER2的表达，诱导乳腺癌细胞对曲妥珠单抗产生敏感性，这可能为曲妥珠单抗的耐药和药物敏感机制探索提供新的思路。 |
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