【原】中国期刊一哥里的心血管研究新思路

作者：叶子（转载请注：解螺旋·医生科研助手）

上周文献精读选取的文章是来自于Cell Research的一篇有关心血管文章，文章的标题是“Direct reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocytes with chemical cocktails”。（回复0426可下载文献）翻译成中文就是“利用化合物鸡尾酒法诱导小鼠成纤维细胞重编程为心肌细胞”，这篇文章和传统的心血管研究思路有所差别，从中可以得到一些新的启发。

科学假说

本文的科学假说主要是根据已有的文献报道：

1、小分子化合物化合物组合能够调控细胞命运转变；

2、已经报道利用小分子化合物组合能够诱导成纤维细胞重编程为多能干细胞；

3、本文探索是否能够利用小分子化合物诱导体细胞直接重编程为心肌细胞

PS: 图片中虚线部分，可作为其他研究方向，展开研究

结果解读

本文主要包括4个Fig，这是典型的Nature风格。Cell Research目前也是国内顶级的生物学类期刊，影响因子最高到了14.8，国内的研究成果发到Cell Research基本上能和国际上的主流期刊媲美。

• Fig1主要是介绍了发现的现象，诱导体系建立；

• Fig2对心肌细胞的功能进行了鉴定；

• Fig3为了更好的将现象和鉴定出来的结果进行验证，作者采用了遗传示踪技术；

• Fig4对于以上的结果进行了初步的机制解析，这里简单的进行了细胞学机制的解析。

Fig1：如何发现并确定现象

Fig1中主要是说小分子化合物组合可以直接诱导小鼠成纤维细胞重编程产生自我跳动能力。

Fig1A介绍了整个诱导重编程的流程图，先是把小鼠的成纤维细胞通过两个阶段的不同培养基和化合物的处理，产生了心肌细胞。

Fig1B中小分子化合物组合CRFVPT处理后不同时间点的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）形态变化。

在显微镜中可以观察到，这些细胞类似于心肌细胞的棒状结构，同时具有跳动能力，像心肌细胞一样在那里一张一缩。从这个现象就确定了整个诱导过程是有可能产生心肌细胞的。

Fig1E是在小分子化合物组合CRFVPT处理后14天后的小鼠尾尖成纤维细胞（TTF）形态变化。

这里有个问题，从什么阶段产生这种有跳动能力的细胞呢？作者进行了时间点的观察，发现在第8天就已经产生了有跳动能力的细胞，在5万的细胞中有10多个细胞跳动，到20天就有100个细胞，效率已经很高了。

Fig1D小分子化合物组合CRFVPT的精简，可以发现在去除了CHIR99021、RepSox、Forskolin、VPA后诱导效率就大大的打了折扣。

做了减法后，开始做加法，看看在原来的化合物里增加一些处理能不能提高诱导效率。

Fig1F：在第二阶段中添加不同因子后诱导TTF产生跳动克隆的作用效果

发现加入NRG1、G-CSF两个因子后，可以使细胞产生的效率进一步提高，两者合用效果也会更好。小分子化合物组合CRFVPT联合Rolipram的作用效果（Fig1G）。

然后作者要检测培养出来的是不是真的心肌细胞，在小分子化合物组合处理MEF后24天检测跳动细胞克隆中心肌细胞的标志物，包括Mef2c、Gata4、Nkx2.5、α-MHC、α-actinin、cTnT、cTnI、N-cad和Cx43。

基本上可以确认这个方法可以把小鼠成纤维细胞转变成具有跳动能力的心肌样细胞。

Fig2：对产生的心肌细胞进行完全的鉴定

Fig2A就是对MEFs、MEF-CiCMs (化合物诱导24天后的跳动细胞克隆) 与心肌细胞的基因表达谱进行分析。Fig2B是对表达水平变化大于5倍以上基因的功能分析（GO）。

接下来对心肌细胞特有的第二特征进行鉴定，首先是钙流实验。

Fig2C：MEF-CiCMs（25天）钙流检测；Fig2D：MEF-CiCMs（25天）钙流频率检测；Fig2D：MEF-CiCMs（25天）钙流消退检测。

之后进行电生理检测。

Fig2F：MEF-CiCMs 的电生理检测

Fig2G：免疫荧光技术检测MEF-CiCMs 中MLC2a、MLC2v、α-actinin和HCN4表达

Fig2H：MEF-CiCMs 的电生理检测参数统计

Fig3：谱系示踪法验证

构建Fsp1-Cre:R26RtdTomato背景的遗传示踪小鼠示意图

Fsp1-Cre:R26RtdTomato背景小鼠来源的MEF在小分子化合物组合CRFVPT处理24天后，检测红色荧光（tdTomato）与不同心肌细胞标志物是否共定位。包括：Mef2c、NKX2.5、α-actinin、cTnT、cTnI和α-MHC。

然后又是一套钙流啊，电生理实验，可以证明CiCMs可以诱导小鼠成纤维细胞重编程为心肌细胞。

Fig4：细胞机制的解析

利用Oct4::GFP报告系统，检测化合物诱导重编程过程是否产生iPSCs。可以发现，从1-26天都没有产生阳性信号。

Fig4B用RT-PCR检测不同化合物诱导时间段的心肌祖细胞标志物基因表达水平，包括：Sca-1、Abcg2、Wt1、Flk1和Mesp1。

Fig4C用免疫荧光染色检测Sca-1阳性细胞及其分化为平滑肌细胞和内皮细胞。

套路分析

如果想进一步检测，第一个可优化就是鉴定RNA-Seq，代替基因表达谱。第二可以从Sigma，Selleck，Tocris等一些公司购买小分子的化合物库，加在CRFV基础上，看看是促进还是抑制。

最后，心肌细胞不仅可以用于筛药，还能在心血管疾病的动物模型上注入心肌细胞，来观察对于不同心血管疾病动物模型的改善情况。

本文整理自上周文献精读班，想加入精读班可点击下图了解详情及报名