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作者：蚍蜉玉 转载请注明：解螺旋·临床医生科研成长平台 自从人类发现了外泌体之后，外泌体就像是如鱼得水，春风十里的在各大癌症疾病中游走，为此外泌体还有个由头就是很有可能是癌症传播的幕后黑手。时至今日，随着科学的进步，人类慢慢探索到了它的奥秘，这个重要的发现便是外泌体不能在前列腺癌症中逍遥法外了，因为遇到了劲敌手霉素A。 那么今天所要阐述的是外泌体在前列腺癌细胞中的作用如何受到抑制，文章题目是：Manumycin A suppresses exosome biogenesis and secretion via targeted inhibition of Ras/Raf/ERK1/2 signaling and hnRNP H1 in castration-resistant prostate cancer cells。在抗癌性前列腺癌细胞中手毒素A通过抑制Ras/Raf/ERK1/2信号和hnRNP H1蛋白通道抑制外泌体的生成和分泌。（回复170911可下载，一周有效） 知识背景介绍 外泌体是由细胞分泌的纳米囊泡（EV），其直径大小约为30-150nm之间，具有闭合的脂质双分子层结构。 在其表面以及胞内中携带蛋白质，脂质和功能性的mRNAs、miRNAs等生物活性物质，在体内参与细胞通讯、细胞迁移、细胞代谢、肿瘤的生成等功能。 Manumycin A （MA）手霉素A是一种天然的微生物的代谢物，在前列腺癌C42B细胞中，而不是前列腺癌RWPE-1细胞中可以抑制外泌体的合成和分泌。 文章的主要内容 1.高通量筛选 CD63-GFP 蛋白（外泌体标记蛋白） 利用两种图书馆查询系统LOPAC（含有1280个临床药物的数据库）和NPC（含有3300个临床标准化合物的数据库）在C4-2B细胞系中做CD63-GFP标记，并且在细胞系中做不同剂量的MA或者DMSO处理后，检测外泌体的分泌。 2.在前列腺癌细胞中，MA抑制了外泌体的合成和分泌 第一：为了评估MA是如何影响外泌体的合成和分泌，课题组首先检测MA是否影响了细胞的生存能力，依赖MA的剂量反应来检测细胞的生存能力，但是在RWPE-1细胞中却没有效果（FIG2a），在 C4-2B细胞系中剂量为250nM48h时会有8%-10%的细胞死亡2b。 因为MA在C4-2B细胞中具有生存能力的影响，所以在C4-2B细胞中，课题组使用了纳米检测通道技术，检测出不同细胞系分泌的外泌体尺寸，颗粒直径，以及颗粒的形式之间是没有差别的。 第二：课题组用NP100 nanopore技术分析在4种细胞系中外泌体的分泌情况，MA（250nM）C4-2B和22Rv1 以及PC-3 3种细胞系后，与对照组相比显著抑制了外泌体的分泌，分别约为50%，65%，60%。然而在作用RWPE-1细胞系之后外泌体的分泌却没有变化。 并且用免疫印迹和PCR技术鉴定，CD9，CD63，CD81，以及外泌体起源的标记物蛋白Alix和TSG101的表达情况。PCR结果显示，四个细胞系中除了PC3之外，Alix和TSG101及CD9与对照组相比表达均升高，而CD81和CD63的核酸水平没有变化。 WB结果显示，四个细胞系中，只有C42B细胞中Alix、TSG101、CD9及CD81与对照组相比蛋白表达水平增高，在PC-3细胞系中Alix、TSG101及CD63的表达水平与对照组相比增高较明显。 第三：构建 pCMV-CD63-GFP 质粒并且在C42B细胞系中稳定表达CD63。在细胞系中用MA（250nM）或者DMSO处理48h后，观察细胞活性是没有差别的，使用qNano-IZON 和 NanoFACS 高通量筛选后发现外泌体的分泌显著减少，另外进一步的通过检测CD63标记GFP的信号也验证了这一观点。 第四：为了解释上述的现象，课题组假设了关键的调控细胞的目标是什么，首先，在通过MA处理的C42B细胞系而不是RWPE1细胞系中，发现MA减少了Alix的表达并且具有剂量依赖性，其次，外泌体合成和分泌的的标记物在梯度离心中被检测到，用MA处理C42B细胞（250nM）48h后，外泌体的标记蛋白Alix, Hrs,和Rab27a 表达下降。 3.MA通过抑制Ras/RAF/ERK信号途径抑制了外泌体的合成和分泌 在CRPC细胞系中，假设Ras信号通路影响了MA诱导的抑制了外泌体的合成和分泌。 第一，课题组使用了Ras信号试剂盒检测MA抑制了Ras信号的活性。 第二，课题组假设MA对RAS信号的抑制，是不是也减少了它下游因子的活性，比如 c-Raf (p-Raf)ERK1/2 (p-ERK) 和总ERK。蛋白分析显示，MA也减少了磷酸化Raf和ERK的蛋白水平，同时影响了总Raf和ERK的蛋白水平。 第三，假设Ras是否选择性调节外泌体合成的标记物Alix的表达和分泌的标记物Rab27a的表达。课题组选择了ERK的抑制剂U0126，在3种细胞系C42B,22Rv1及PC-3中验证，结果表明ERK的抑制剂U0126抑制了Alix的表达和Rab27a的表达。 这结果直接显示，Ras调节MA抑制的外泌体的合成和分泌。 4.MA通过ERK依赖的抑制剂hnRNP H1 抑制了外泌体的合成和分泌 课题组首先假设核质蛋白hnRNP H1 与Ras信号途径和外泌体的合成与分泌相关。因此在C4-2B, 22Rv1和PC-3 细胞系中，观察到ERK活性抑制以后，hnRNP H1的表达水平下降；在MA处理4C4-2B, RWPE-1，22Rv1和PC-3细胞系时，hnRNP H1的表达水平也下降。 最后使用qNano-IZON和NP-100 nanopore分析沉默hnRNP H1以后显著降低了外泌体的释放，程度大约70%。综上所述，hnRNP H1与MA抑制的外泌体的释放与合成相关。
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