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京港感染论坛 感染病诊治，你我同参与 作者｜贾举 急性呼吸道感染的临床症状和体征并不具备病原特异性。高灵敏度和特异性的核酸扩增试验已成为诊断病毒的参考标准，另外将基础研究中的细菌检测方法转化为常规临床实践也是呼吸医学领域令人兴奋的进步。最近，分子诊断手段在全球应对新型冠状病毒大流行中发挥了重要作用。考虑到多种多样的分子检测方法和日新月异的技术手段，如何最好地结合临床判断和传统检测方法来使用急性呼吸道感染的最新分子检测方法常引起困惑。因此，本文总结了病毒和细菌引起的急性呼吸道感染诊断的最新进展，基于以患者为中心的角度为诊断决策提供一个实用框架，并为推动这一领域发展的研究提出建议。 过去十年间，美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准的急性呼吸道感染的分子诊断方法数量显著增长（表1）。能够检测一种或多种病毒的高灵敏度和特异性的核酸扩增试验（nucleic acid amplification tests，NAATs）已成为临床病毒学的诊断“金标准”。此外，一些最新的检测方法能够检测和明确细菌性肺炎最常见的病原以及某些特定的耐药决定因素。临床医生和微生物实验室目前有许多诊断检测方法可选，可以在几分钟到几小时内得到结果。决定选择哪种方法或不同方法的组合，以及何时使用，取决于多个因素，包括临床背景、实验室资源、工作流程和成本。 表1. FDA批准的急性呼吸道感染分子诊断方法 FDA的网站包含更完整的检测列表：https://www./medical-devices/vitro-diagnostics/nucleic-acid-based-tests 。 定义：“Direct”表示检测直接使用拭子，不需要输送介质；“Atypical” bacteria可能包含百日咳鲍特氏菌、肺炎衣原体等；“Multiple viruses”可能包含腺病毒、冠状病毒、流感病毒等：“Multiple bacteria”可能包括大肠杆菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌群、金黄色葡萄球菌、嗜麦芽窄养单胞菌、无乳链球菌、肺炎链球菌和化脓性链球菌等。 缩略词：BAL,支气管肺泡灌洗液；ETA,气管内抽吸物；NPA,鼻咽部吸出物；NPS, 鼻咽拭子；NS,鼻拭子；NW,鼻洗液；S,诱导/咳出痰。 a、FDA根据诊断检测的复杂程度进行分类。非实验室技术人员也可以进行豁免检验的操作。中度至高度复杂检验必须在合格的实验室或符合某些监管要求和质量标准的场所进行。 b、包括从标本采集到实验室报告结果的时间。 c、成本费用(美元)是指试剂的报价，并不包括仪器成本、折旧和人工。$ = 1-25,$$ = 26-50, $$$ = 51-100, $$$$ = 101-150, $$$$$ =151-200。 最近的研究探讨了呼吸系统NAAT对临床结局和资源利用的潜在影响。不过大部分文献集中在病毒检测领域，其中大多数仅针对流感病毒。流感的快速分子检测能够避免不必要的抗生素使用、改善抗病毒药物处方、减少额外的辅助检测以及缩短在医院或急诊科的住院时间。从实验室的角度来看，同时对多种呼吸道病毒进行分子检测也比传统的基于抗原或培养的检测方法更节省成本。图1描述的是与检测方法效果相关的关键组成的概念模型。 图1. 分子检测效果的概念层次模型 美国感染病学会(Infectious Diseases Society of America，IDSA)的诊断委员会对呼吸系统分子检测方法的文献进行了全面回顾。该项目有如下目标：（1）对已有证据支持的病毒和/或细菌检测方法的临床情况进行分类；（2）强调对患者管理和抗菌药物管理产生影响的检测结果解释中的细微差别；（3）识别关键的知识缺口，以指导未来的研究。在MEDLINE、Embase和Cochrane Library数据库中检索，重点是最近5年(2015-2019年)发表的同行评议过的稿件，并且在2020年3月进行了一次更新，以特别关注越来越多的SARS-CoV-2相关文献。通过对这些单篇文章进行标准化评估，本文总结了FDA批准的分子测试方法合理使用相关的几个关键临床问题。 问题1：检测还是不检测？这是首要问题 当决定是否对疑似急性呼吸道感染患者进行检测时，首先要考虑的是“检测结果对接下来的临床管理产生何种影响?”这个问题的答案取决于许多因素，包括患者病情的严重程度、症状的持续时间、合并症、免疫抑制的状态、其他可用的辅助检查结果，以及预期的病情好转的时间。此外，疾病流行情况对诊断检测的决定也是必不可少的，因为它影响着检测结果的阳性和阴性预测值（predictive values）。 在流感流行性较低的期间出现上呼吸道感染的健康儿童不一定需要进行流感特异性检测。因为在此期间，阳性检测结果很可能是假阳性。图2说明了流感流行情况对NAAT预测值的影响。 图2. 验前概率的重要性 基于目前已发表的流感分子检测的敏感性和特异性，典型的流感季期间快速分子检测的预测值在图中展示。缩略词：NPV，阴性预测值；PPV，阳性预测值 此外，由于患者抗流感治疗的适应症不明显，流感特异性检测不太可能影响抗病毒治疗处方的决定。不过如果患者有明显的免疫缺陷，有严重的流感样疾病，或者如果发现另一种呼吸道病毒会影响抗病毒药物或抗生素停用的处方决定，此时就需要对多种病毒进行综合性检测。 虽然对分子检测的成本和效益进行评估的研究相对较少，但建模研究表明，在疾病中度流行时期或严重疾病风险为中至高度时，检测后再治疗的策略通常比直接经验抗流感治疗更可取。对门诊患者来说，就诊是就得到流感检测结果更加有用；急诊患者最好两小时内得到结果。 COVID-19的诊断的最佳方案正在不断地更新。在社区传播环境中，对所有有症状的个人进行检测是为之后进行通报隔离、追踪接触者和评估流行病学变化的最佳选择。 对其他非流感病毒的类似建议仅针对免疫抑制宿主，推荐除了流感外，还要对多种病毒同时进行初步检测。美国儿科学会反对对毛细支气管炎患儿进行常规病毒检测。在正常成年人中，非流感病毒分子检测结果对抗生素处方和/或住院时间的影响很可能与流感存在不同。然而，由于样本量有限，还无法得出明确的结论，而且很少有研究专门评估对免疫抑制宿主管理的影响。 直到最近，商用的NAAT检测方法还仅限于病毒病原体和部分“非典型”细菌，包括肺炎支原体、肺炎衣原体和鲍特菌属细菌。另外很明显，在胸部X片上出现新的或恶化的浸润是抗生素使用的独立预测因素，从而不需要考虑呼吸道病毒的检测。因此，明确地排除疑似病毒感染患者的细菌共感染可能有助于减少不必要的抗生素使用。 目前的社区获得性肺炎(community-acquired pneumonia，CAP)和医院或呼吸机相关肺炎(hospital- or ventilator-associated pneumonia，HAP和VAP)指南除了建议对HAP/VAP患者进行鼻腔耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）筛查外，并未推荐对其他细菌病原体进行分子检测。由于多重细菌性肺炎（multiplex bacterial pneumonia）研究尚新，它们的分子测试效果和对临床决策的潜在影响尚不明确。在缺乏高质量数据的情况下，细菌NAAT可能对以下情况中的患者最有意义:有新的或恶化的肺部浸润，中度至重度疾病，在样本病原培养之前已经接受经验抗生素治疗，存在耐多药细菌或多种细菌混合感染。 最近的一次会议强调了病毒和细菌联合检测的重要性，因为临床导向的检测可能会遗漏潜在的重要病毒病原体。患者很有可能从病毒和细菌综合检测中受益，例如，尽管培养结果为阴性，但MRSA的分子检测阳性结果也能继续支持万古霉素的使用。此外，流感分子检测阴性结果与流感嗜血杆菌的检测相结合，可以考虑更加针对革兰氏阴性菌的治疗，同时停止抗病毒治疗。 问题2：决定进行检测，何种方案最好 在最近一项荟萃分析中，快速病毒NAAT的综合敏感性和特异性分别为90.9%和96.1%。美国疾病控制与预防中心（Centers for Disease Control and Prevention，CDC）和IDSA的流感指南都支持在门诊和住院进行流感分子检测，而不是抗原检测。但对所有患者进行流感分子检测是否是成本和效益最优的方法仍不确定。 世界卫生组织于2020年1月30日将新型冠状病毒肺炎疫情宣布为国际关注的突发公共卫生事件。此后，超过24种不同的NAAT检测方法已经被FDA授权紧急使用。已知灭活病毒的浓度被用来确定这些检测方法的分析特征。 现有证据表明，在鼻咽部和口咽部标本中可检测到SARS-CoV-2，其测量值的峰值水平通常在症状出现的第一周。鼻咽部样本可能比口咽样本更敏感，但检出率似乎因人而异，且在疾病进展中有所变化。与其他病毒性感染一样，呼吸道分泌物中病毒RNA的排毒期可能持续到症状消失和血清转化之后。这些病人是否仍有传染性尚不清楚，仍有许多工作要做。 针对多种病毒的同时多重检测对儿科患者可能最具价值，它可以减少不必要的抗生素使用和胸片检查。与此相反，一项研究评估了流感流行季节期间门诊成人病人的多重NAAT分析结果，表明这些患者群体中，单独检测流感可能比综合检测的方法更具效益。多重病毒NAAT检测(可能与细菌结合)对免疫功能低下和肺炎重症患者以及气道疾病加重患者也有临床意义。上述情况应该考虑对呼吸道合胞病毒或腺病毒等非流感病毒进行治疗，快速检测结果最有可能影响后续经验性广谱抗生素应用。 临床医生和实验室人员有必要了解每个不同的检测策略所涵盖目标的检测方法特征，特别是检测结果将影响抗生素使用级别。即使是最大的多重检测策略也不能检测所有潜在的病原体，而设计最佳的方案仍然在讨论中。因此，目前的检测方法还不能取代细菌和真菌培养的药敏试验。培养对于流行病学研究、疫苗相关决策和当地抗菌谱的研究也至关重要。 目前的细菌性肺炎检测用下呼吸道样本，但FDA根据检测方法不同推荐特定样本类型(如痰、气管内和/或支气管)。目前正在研究，同时从同一患者收集的不同类型的样本比较诊断阳性率。这种比较将有助于评估检测结果的整体预测值。此外，上呼吸道病毒和非典型细菌检测阴性并不足以排除下呼吸道感染可能性，例如，在严重流感患者中，上呼吸道病毒排毒期的中位数为6天，而在下呼吸道样本中为11天。一项成人呼吸道合胞病毒研究也表明下呼吸道样本比上呼吸道更敏感。因此，当临床对流感或呼吸道合胞病毒感染有强烈怀疑时，建议在上呼吸道检测阴性后进行下呼吸道样本采样检测，免疫抑制的患者也应如此。 问题3：应该如何解释下呼吸道检测出的细菌DNA的意义 分子诊断方法通常比培养法能检测到更多的病原菌。这反映了NAAT在检测潜在的死亡，营养条件严苛，定植或代谢受损的微生物固有的敏感性。对标本采集时患者的抗生素使用情况进行评估对解释NAAT检测阳性且培养阴性结果至关重要。同样需要明确，无论是培养法还是NAAT检测都不能将气道定植微生物与入侵的病原体区分开。然而，使用定量方法可以提高VAP培养的临床特异性，值越高越能预测真实感染。对比于检测方法中的校准样本计算，将细菌检测的半定量计量分为104、105、106和大于107个基因组拷贝/mL的数量级。低于103.5基因组拷贝/mL则报告为“未检测到”。一般而言，基因组单位与培养定量之间存在中度相关性，基因组拷贝数/mL往往高于相应的菌落形成单位/mL的数值。 例如患者的肺泡支气管灌洗液中MRSA核酸的浓度远远高于流感嗜血杆菌，那么其中低水平的流感嗜血杆菌检测结果可能仅仅代表其为气道定植，培养阴性结果可能是因为先前使用过抗生素。一项小型单中心研究观察到NAAT检测结果中基因拷贝数/mL较高的患者重症监护病房的住院时间更长以及肺炎出院诊断需要的指征更多，这表明这种定量数值可能有临床价值，可以帮助临床医生区分真正的感染和定植。 问题4：与抗生素管理相结合能否增强呼吸诊断检测的效果 抗菌药物管理指南提倡对广泛的呼吸道病毒进行快速检测，作为减少不适当抗生素使用的一项重要干预措施。然而，目前尚无任何干预性研究评估基于多重NAAT检测结果进行抗生素降级使用的安全性和有效性。在病毒检测阳性、细菌培养阴性且胸部成像正常时，在抗生素管理相关研究中可观测到停用抗生素的比率最高（51%）。其他情况下，只有比较低抗生素停用率(14-24%的病例)。这种差异是由于无法在一段时间内明确排除细菌共感染。通过呼吸道病毒NAAT检测结合血清生物标志物(如降钙素原)或能提示病毒而非细菌感染的宿主免疫反应谱可能具有积极意义。 呼吸道标本细菌的分子检测能比传统培养法检出更多的微生物，这一事实引起人们关于多重NAAT检测可能反而增加了抗菌药物的使用。分子检测只只能探测到最常见的耐药决定因素，检测策略未涵盖的微生物的耐药基因也会使情况复杂。结合使用血清生物标志物或宿主免疫反应的分子检测和抗生素管理能否促进安全地减少抗生素的使用，还需要进一步探索。 结论以及临床建议 分子诊断学彻底改变了呼吸道病毒的检测。与传统的以培养和抗原为基础的检测方法相比，分子检测具有很高的敏感性，并且可以为临床流出周转时间来减少诊断的不确定性并帮助指导早期的管理决定。最新的涵盖SARS-CoV-2病毒的分子检测方法也已诞生，虽然尚不清楚SARS-CoV-2是否会变为季节性流行，但未来该病毒很可能作为呼吸道综合分子诊断策略的一部分。 一般而言，呼吸NAAT检测中度验前概率（pretest probability）和疾病严重程度的情况下最有用。在此情况下，阴性检测可以继续保留对潜在病原体的初步经验治疗，而阳性检测可以集中针对特定病原体进行治疗，从而提高治疗效果，并减少不必要的额外检测。 当从实验室及整个医院系统层面上做出采纳引进分子诊断技术的决定时，应该考虑这些方法在指导制定方案和政策方面的价值，例如，在医院流行病学和抗生素管理方面。随着技术的进步和实践中支持证据的出现，必须不断评估这些方法策略的有效性。 贾 举 首都医科大学儿科学硕士，北京协和医学院内科学博士研究生在读，师从中日友好医院曹彬教授，主要从事流感等呼吸系统感染性疾病相关研究工作。 END 审稿｜宁永忠、鲁炳怀 |
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