​电针对创伤性颅脑损伤大鼠损伤区皮层自噬相关蛋白表达的影响

电针对创伤性颅脑损伤大鼠损伤区皮层自噬相关蛋白表达的影响

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      创伤性颅脑损伤(traumatic brain injury，TBI)是常见的脑外科疾病，由于直接或间接暴力作用于头部，损伤脑实质，引起暂时或永久性的意识丧失、记忆缺失、认知及神经功能障碍等，致残率和死亡率极高。根据病理性质可将TBI分为原发性和继发性，由于直接冲击造成的原发性颅脑损伤难以逆转，但是继发的一系列神经炎性反应及神经功能缺失所引起的偏瘫、智力减退等通过治疗可以得到缓解。

       临床上电针治疗TBI疗效确切^[1]，但在发生TBI后何时介入电针治疗效果最佳及其具体治疗机制尚不明确。

        AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是广泛存在于细胞中的一条重要信号通路，在细胞代谢和应激中起关键作用，通过影响其下游多种效应分子的活化状态，促进细胞生长、调控自噬、抑制凋亡^[2]。此研究拟初步明确电针对TBI的早期治疗效应，从自噬的角度，观察电针对TBI大鼠AMPK/mTOR通路自噬相关蛋白的调节作用，探讨电针促进TBI康复的作用机制。

01

材料与方法

1.实验动物与分组

     SPF级健康6周龄雄性SD大鼠40只，体质量(200±20)g。适应性饲养7d后将大鼠随机分为假手术组、模型组、电针Ⅰ组、电针Ⅱ组，10只/组。

2.TBI模型制备

    2％戊巴比妥钠(0.2mL/100g)腹腔注射麻醉大鼠，参照Feeney的自由落体方法加以改良制备大鼠左侧TBI模型。固定大鼠于脑立体定位仪，沿正中线左侧旁开5mm处开一长约1.5cm的纵向切口，用电磨机于冠状缝后6mm、矢状缝左侧旁开4mm处钻出一直径5mm的小孔，用20g砝码由35cm高度的透明玻璃管中垂直下落打击小孔，造成左脑顶叶中度损伤。缝合皮肤后单笼饲养。假手术组仅钻开头骨，无打击。术后连续7d腹腔注射庆大霉素(0.5mg/100g)注射液抗感染治疗。

3.干预方法

“水沟”(直刺1mm)，点刺20s后出针

“百会”(向前斜刺2mm)，留针10min

患侧“内关”(直刺1mm)，“足三里”(直刺7mm)；此二穴接电针仪，强度以动物肢体轻微抖动为宜，约1mA，断续波，频率2Hz，留针10min，1次/d。

     于建模后第7天开始对电针Ⅰ组大鼠进行电针干预，连续7d；于建模后24h开始对电针Ⅱ组大鼠行电针干预，连续14d。

4.观察指标与检测方法

HE染色观察大鼠损伤区脑组织形态结构的变化

尼氏染色观察大鼠损伤区脑组织神经元变化

Western blot法检测AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、Ulk1、p-Ulk1表达

02

结果

1.各组大鼠损伤区脑组织皮层病理形态的比较

HE染色显示

假手术组神经元分布均匀、排列整齐、形态结构正常，胞核多为圆形蓝染，胞质为粉红淡染，无坏死、渗出。

模型组可见细胞核固缩、破碎等，空泡明显，出现坏死区域，可见瘢痕组织。

电针Ⅰ组、电针Ⅱ组受损脑组织空泡样改变与瘢痕较模型组明显减少，电针Ⅱ组恢复情况优于电针Ⅰ组。见图1。

尼氏染色显示

假手术组的尼氏小体分布均匀，呈斑片、虎斑或颗粒状。

模型组损伤区尼氏小体的数量明显减少。

电针Ⅰ组、电针Ⅱ组尼氏小体缺失数量均较模型组减少。见图2。

2.各组大鼠损伤区脑组织皮层中AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、Ulk1、p-Ulk1蛋白表达的比较

与假手术组比较

模型组大鼠损伤区脑组织皮层中p-AMPK/AMPK显著升高(P＜0.01)，p-mTOR/mTOR、p-Ulk1/Ulk1均显著降低(P＜0.01)。

与模型组比较

两电针组p-AMPK/AMPK显著降低(P＜0.01)，p-mTOR/mTOR、p-Ulk1/Ulk1显著升高(P＜0.01)。

与电针Ⅰ组比较

电针Ⅱ组p-AMPK/AMPK明显降低(P＜0.05)，p-mTOR/mTOR、p-Ulk1/Ulk1明显升高(P＜0.05)。见图3。

03

讨论

     电针在治疗TBI等神经系统疾病方面效果较好^[3-6]，并引起医学界的广泛关注。相关研究^[4,7]表明“足三里”“百会”“内关”“水沟”是治疗TBI的优选腧穴。百会位居巅顶，属督脉，有“三阳五会”之称，可醒脑安神、振奋阳气、升清化浊。水沟亦属督脉，为醒脑苏厥之要穴。内关属八脉交会穴，亦是手厥阴心包经之络穴，“络心系”，故可调神定志。足三里为足阳明胃经之合穴，可“疗五劳羸瘦，七伤虚乏”，又有“治痿独取阳明”之说，可濡润宗筋，乃强壮人体之必取穴。诸穴合用，可醒脑开窍、调和阴阳、通经活络、补益气血，促进TBI的康复。

     自噬与凋亡是颅脑损伤后神经元的重要生理病理变化基础^[8-9]，由于刺激的程度和刺激时间的不同，凋亡和自噬的强弱有所差别。但随着缺血时间的延长，自噬被过度激活，导致细胞受损，进而引发细胞凋亡，并最终通过凋亡依赖途径诱导细胞死亡^[10]。

    AMPK/mTOR信号通路在调控自噬中起着枢纽的作用^[11]。活化的AMPK可通过磷酸化结节性硬化复合体(TSC2)激活TSC1/2，进而抑制小GTP酶Rheb，负向调控mTOR功能，抑制mTOR磷酸化，促进自噬的发生^[12]。此外，AMPK也可以通过磷酸化联接蛋白raptor，阻碍raptor与mTOR或mTOR与底物的结合，同样抑制mTOR的活化^[13]。

     本研究显示，与假手术组比较，模型组p-AMPK蛋白表达水平上调，p-mTOR的表达下调，表明颅脑外伤后AMPK被激活，自噬活性增强，且AMPK与mTOR在自噬的调节中相互协调制约。其中p-Ulk1的表达趋势与p-mTOR相似，表明TBI发生后p-AMPK抑制了mTOR的活化，同时也抑制了mTOR与Ulk1的相互作用，促进了自噬的发生。电针干预能够显著下调p-AMPK相对表达水平，上调p-mTOR、p-Ulk1相对表达水平，提示电针可能是通过抑制AMPK的磷酸化，促进mTOR与Ulk1的活化，进而抑制神经元发生过度的自噬，从而发挥脑保护作用。电针Ⅱ组大鼠脑组织损伤改善情况明显优于电针Ⅰ组，此结果与课题组前期研究结果一致，同时与电针Ⅰ组相比，电针Ⅱ组脑组织中p-AMPK/AMPK明显降低，而p-mTOR/mTOR、p-Ulk1/Ulk1均升高，表明电针早期介入治疗对神经元自噬的调控作用更明显。

     综上所述，电针可能是通过调节AMPK，mTOR和Ulk1等自噬相关蛋白的活化状态来抑制脑神经元自噬的过度活化，从而发挥对TBI的神经保护作用。

04

参考文献

1. 彭璠,陈泽奇,罗杰坤.持续电针为主促醒重型颅脑外伤昏迷患者疗效观察[J].中国针灸,2010,30(6):465-468.

2. LIANG P, JIANG B, LI Y, et al. Autophagy promotes angiogenesis via AMPK/Akt/mTOR signaling during the recovery of heat denatured endothelial cells[J]. Cell Death Dis,2018,9(12):1152-1173.

3. 李佳诺, 孙忠人, 尹洪娜,等.针刺对颅脑损伤后相关因素影响的动物实验研究进展[J]. 针灸临床杂志, 2017, 33(6):74-77.

4. LI X, CHEN C, YANG X, et al. Acupuncture improved neurological recovery after traumatic brain injury by activating BDNF/TrkB pathway[J]. Evid Based Complement Alternat Med,2017,2017: 8460145.

5. 张毅敏, 陈爱连, 唐纯志,等.电针对重型颅脑损伤昏迷患者促醒作用的临床观察[J]. 针刺研究,2013,38(2):158-162.

6. 郭子泉, 黄泳, 姜华,等.早期针刺治疗颅脑创伤后肢瘫痪的疗效及作用机制研究[J]. 针刺研究,2019,44(8):589-593.

7. 林淑君, 张玉娟, 林吉欢,等.针刺对创伤性脑损伤大鼠神经损伤的影响[J]. 针刺研究,2019,44(1):23-28.

8. ZHANG M, SHAN H, CHANG P, et al. Hydrogen sulfide offers neuroprotection on traumatic brain injury in parallel with reduced apoptosis and autophagy in mice[J]. PLoS One,2014,9(1):e87241.

9. 刘昊, 张菶, 李新伟,等.针刺对出血性中风大鼠脑组织自噬相关蛋白表达的影响[J]. 针刺研究,2019,44(9):637-642.

10. EISENBERG-LERNER A, BIALIK S, SIMON H U, et al. Life and death partners: apoptosis, autophagy and the cross-talk between them[J].Cell Death  Differ ,2009,16(7):966-975.

11. JOUNGMOK K, MONDIRA K, BENOIT V, et al. AMPK and mTOR regulate autophagy through direct phosphorylation of Ulk1[J]. Nat Cell Biol,2011,13(2):132-141.

12. BAI L, MEI X, SHEN Z, et al. Netrin1 improves functional recovery through autophagy regulation by activating the AMPK/mTOR signaling pathway in rats with spinal cord injury[J]. Sci Rep,2017,7:42288.

13. GWINN D M, SHACKELFORD D B, EGAN D F, et al. AMPK phosphorylation of raptor mediates a metabolic checkpoint[J]. Mol Cell,2008,30(2):214-226.

来源：谷婷,吴涛,王瑞辉,杨欢,柯增辉,王东,陈星,杨挺,孟晓鹏.电针对创伤性颅脑损伤大鼠损伤区皮层自噬相关蛋白表达的影响[J].针刺研究,2020,45(07):524-528+547.

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