【原】Chem. Sci.：自组装的两亲性荧光探针用于肿瘤细胞和组织的pH检测

CBG资讯公众号 2020-10-05

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一般而言，癌细胞无法自给自足，通过汲取健康细胞和细胞外基质的各种营养，在厌氧条件下也能生长，这使得肿瘤微环境变得不均匀，对肿瘤的治疗和诊断产生障碍。癌细胞中的厌氧糖酵解将葡萄糖代谢为乳酸，导致癌细胞环境变成酸性，进而形成酸中毒（沃堡效应），这使得免疫系统错误地识别癌变的组织和细胞。此外，酸中毒提供了有利于肿瘤血管生成的环境。因此，检测细胞器水平的pH差异和波动不失为识别癌症的有效方式。

基于此，韩国基础科学研究所的Kwan Soo Hong、印度Amrita Vishwa Vidyapeetham大学的Sankarprasad Bhuniya和美国德克萨斯大学奥斯汀分校的JonathanL. Sessler课题组合作设计了一种两亲性长链pH荧光探针（CS-1），用于区分正常细胞与癌细胞，同时定性监测癌细胞和非癌细胞的膜表面以及各种细胞器内的pH波动，该探针为肿瘤疾病的诊断和研究提供一定基础。相关成果以“Self-assembledamphiphilic fluorescent probe: Detecting pH fluctuations within cancer cellsand tumour tissues”为题发表在Chemical Science上（DOI: 10.1039/D0SC03795H）。

首先，作者通过6个连续步骤合成了探针CS-1。作者以N-(2-溴乙基)邻苯二甲酰亚胺为原料经过2步反应高收率获得化合物2；以A为原料与乙二胺反应得到化合物3；3与溴乙酸叔丁酯进行N-烷基化反应得到中间体4，4与2反应得到化合物5；最后，用三氟乙酸进行脱保护得到长尾两亲性pH探针CS-1（Scheme 1a）。同时，为了研究标记为N（a’/b’）的氨基中心在pH依赖性荧光响应中的作用，作者制备了两种参考物R1和R2。作者猜测探针CS-1可在pH 4.0的条件下进行自组装且在pH 7.0的条件下解聚（Scheme 1b）。

（来源：Chemical Science）

为了探究探针CS-1是否可以通过绘制pH波动来区分癌细胞和正常细胞，作者用A549（人肺腺癌细胞）、AGS（人胃腺癌细胞）和MRC-5（人正常胚肺成纤维细胞）进行荧光成像研究。经流式细胞仪分析（Figure 1a和1b），作者发现用CS-1（20 μM）处理细胞，癌细胞A549和AGS的标记水平分别高达90%和82%，而正常细胞MCR-5仅为20%，表明探针CS-1能够基于细胞内外pH值变化将癌细胞和正常细胞区分，无需特定的肿瘤靶向配体。此外，经CS-1处理的细胞的荧光强度随pH的增加而减弱（Figure 1c和1d），这表明探针CS-1可以作为细胞酸中毒的标志。

（来源：Chemical Science）

随后，作者探究了CS-1的细胞器定位情况随时间的变化以及不同pH条件下的定位情况。作者用特异性定位质膜的荧光探针与CS-1和细胞共孵育，获得了共定位系数随时间变化的荧光图像，结果表明随着时间的推移，CS-1与质膜荧光探针的重叠系数先增大后减小，且最大时也仅为0.45（Figure 2a和2b）。除此之外，作者通过改变细胞的pH值（5-8）发现重叠系数随着pH值的增加直线下降（Figure 2c和2d）。因此，作者通过标准质膜标记物确定探针CS-1的重叠系数从而估算血浆pH为6.0-6.8，这与文献报道的相一致。

（来源：Chemical Science）

接着，作者结合溶酶体示踪剂获得了人肺腺癌细胞A549细胞中CS-1随时间和pH变化的荧光图像。随着时间的延长（10-30分钟），CS-1与溶酶体示踪剂的共定位程度逐渐增加，表明CS-1逐渐从细胞表面迁移至溶酶体（Figure 3a和3b）。当pH为5时共定位系数达到最高值，这与溶酶体的pH在4-6范围的假设一致。而在正常细胞MRC-5中，虽然共定位系数随着时间的延长而增大，但远小于A549的结果（Figure 4a和4b），且不随pH的改变而改变（Figure 4c和4d）。

（来源：Chemical Science）

在癌细胞的线粒体ATP合成过程中，快速的氧化磷酸化水平与酸中毒息息相关，因此作者猜测探针CS-1可以定位于线粒体中，从而估计线粒体酸中毒的程度以及线粒体外膜内部或附近的相对质子浓度。作者结合MitoTracker获得了A549细胞中CS-1随时间和pH变化的荧光图像。在孵育60分钟后，探针CS-1大部分位于线粒体中，共定位系数高达0.87（Figure 5a和5b）。pH依赖性共定位研究表明，当pH小于6时，CS-1与MitoTracker的共定位程度相对较高，当pH为5时共定位系数高达0.89，说明癌细胞的线粒体pH值约为5（Figure 5c和5d）。除此之外，作者发现当pH为5时，质膜、溶酶体和线粒体的共定位系数增加到0.68、0.84和0.89（Figure 2, 3和5），所以CS-1在各种细胞器中的共定位程度也取决于各个细胞器的pH。

（来源：Chemical Science）

最后，基于CS-1可以标记直径为300 μm的A549球状体产生绿色荧光响应（Figure 6a），作者在携带A549异种移植的Balb/c裸鼠中用CS-1进行肿瘤标记。尾静脉注射CS-1 24小时后，作者将小鼠处死并解剖肿瘤，发现肿瘤组织切片产生强烈的荧光，特别是肿瘤边界区域，而肌肉和肝脏区域几乎没有荧光（Figure 6b）。另外，在肿瘤边界处观察到的荧光强度比其他器官增强约8倍（Figure 6c）。