写在前面之前发布的《扩增子图表解读》系列,相信很多朋友都看过了。 这些内容的初衷是写给刚进实验室的学生读,加速大家对同行文章的解读能力。如果连同行的结果都看不懂,何谈对数据的理解,对科学问题的解释。希望刚入行的小伙伴多读高水平文章,配合我的解读,定能让理解上升一个层次。 《扩增子分析解读》系列文章介绍扩增子分析是目前宏基因组研究中最常用的技术,由于微生物组受环境影响大,实验间重复较差,更需要更多的实验重复和分析技术来保证结果的准确性、可重复性。 本系统文章叫分析解读,即有详细的扩增子分析流程代码,又有本人对使用参数、备选参数意义的解读,可以让大部分零基础的人,更好的理解数据分析过程,并可亲自实践在自己的课题上,获得更好、更合理的实验结果。 本文采用目前最主流的扩增子测序数据类型HiSeq2500 PE250类型数据为例,结合目前主流方法QIIME+USearch定制的分析流程。本课程中所需的测序数据、实验设计;和课程分析生成的中间文件,均可以直去百度云下载。后台回复"扩增子"获取。 本课程代码的运行,至少需要Linux平台+安装QIIME1.9.1,我发布过三种安装QIIME的方法详见文章目录,总有一款适合你。 第四节. 去嵌合体,非细菌序列,生成代表性序列和OTU表本节课程,需要完成 先看一下扩增子分析的整体流程,从下向上逐层分析。 分析前准备# 进入工作目录
cd example_PE250 上一节回顾:我们制作了Usearch要求格式的Fasta文件,对所有序列进行去冗余和低丰度过滤,并聚类生成了OTU。 接下来我们对OTU进一步去除嵌合体,并生成代表性序列和OTU表。 什么是chimeras(嵌合体)?嵌合体序列由来自两条或者多条模板链的序列组成,示意图如下: 在PCR反应中,延伸阶段由于不完全延伸,就会导致嵌合体序列的出现,以上图为例, 在扩增序列X的过程中,在序列延伸阶段,只产生了部分X序列延伸阶段就结束了,在下一轮的PCR反应中,这部分序列作为序列Y的引物接着延伸,扩增就会形成X和Y的嵌合体序列; 在放一张具体一点的示意图,不完全延伸产生的序列作为下一轮PCR反应的产物,进行延伸 通常在PCR过程中,大概有1%的几率会出现嵌合体序列,而以在16S/18S/ITS 扩增子测序的分析中,系统相似度极高,嵌合体可达1%-20%,需要去除嵌合体序列。 嵌合体的比例与PCR循环数相关,循环数越高,嵌合体比例越高。 有玩过魔兽有小伙伴记得精灵族的终极兵种双头龙奇美拉吗?它的英文就是chimera,即中文的嵌合体,奇美拉是音译。 10. 基于数据库去嵌合体(可选)上文第9步,聚OTU时,已经按照组内的序列相似情况,直接denovo去除了大量嵌合体。目前这步基于数据库去嵌合体,在以前的分析中是必做的,但随着技术发展,发现这步可能也会造成假阴性。读者可以实验设计、初步结果和预期来判断是否需要这步处理。本文示例对每一步均进行操作,即是个人风格,又是为了给大家展现一个比较全面的流程。之前Usearch作者推荐使用RDP数据 去嵌合,并提供了下载链接;现在作者建议,如果做,就用Sliva或Unite这种全面的大数据库,不推荐用RDP这种小数据库,以前的建议是错的。软件方法均是不断进步的,我还没有系统比较作者的新建议有多大改进,这里还是按照原来的方法进行,读者可以自行尝试新方法。 # 下载Usearch8推荐的参考数据库RDP
wget http:///uchime/rdp_gold.fa
# 基于RDP数据库比对去除已知序列的嵌合体
./usearch10 -uchime2_ref temp/otus.fa -db rdp_gold.fa -chimeras temp/otus_chimeras.fa -notmatched temp/otus_rdp.fa -uchimeout temp/otus_rdp.uchime -strand plus -mode sensitive -threads 96 采用-uchime2_ref参数去嵌合体,后面接OTU序列(输入文件); 上面计算结果 我们想要是的排除嵌合的部分,即53+2782=2835。思路是将全部OTU中鉴定为嵌合的排除掉。 # 获得嵌合体的序列ID
grep '>' temp/otus_chimeras.fa|sed 's/>//g' > temp/otus_chimeras.id
# 剔除嵌合体的序列
filter_fasta.py -f temp/otus.fa -o temp/otus_non_chimera.fa -s temp/otus_chimeras.id -n
# 检查是否为预期的序列数量
grep '>' -c temp/otus_non_chimera.fa # 2835 11. 去除非细菌序列(可选)此步也是非必须的,容易造成假阴性。分析中有很多个人习惯的因素在里面,所以不同人的分析结果,也会略有不同。也缺少系统的评估到底那些更好,因为好与不好是有条件的,如何判断也不容易説清楚,这就是经验;项目经验是经过大量的项目反复研究积累出来的。 这步的原理是将OTU与Greengene (http://greengenes.)的Align数据库比对,筛选序列相似性大于75%以上的序列作为细菌序列;此步可以排除外源非细菌的污染,非细菌序列在接下来的分析中无法注释物种分类,也很难分析。 # 下载Greengene最新数据库,320MB
wget -c ftp://greengenes.microbio.me/greengenes_release/gg_13_5/gg_13_8_otus.tar.gz
# 解压数据包后大小3.4G
tar xvzf gg_13_8_otus.tar.gz
# 将OTU与97%相似聚类的代表性序列多序列比对,大约8min
time align_seqs.py -i temp/otus_non_chimera.fa -t gg_13_8_otus/rep_set_aligned/97_otus.fasta -o temp/aligned/
# 无法比对细菌的数量
grep -c '>' temp/aligned/otus_non_chimera_failures.fasta # 1860
# 获得不像细菌的OTU ID
grep '>' temp/aligned/otus_non_chimera_failures.fasta|cut -f 1 -d ' '|sed 's/>//g' > temp/aligned/otus_non_chimera_failures.id
# 过滤非细菌序列
filter_fasta.py -f temp/otus_non_chimera.fa -o temp/otus_rdp_align.fa -s temp/aligned/otus_non_chimera_failures.id -n
# 看我们现在还有多少OTU:975
grep '>' -c temp/otus_rdp_align.fa 经过这一步过滤,从2835非嵌合的OTU,只剩下975个与细菌相似的OTU,这种数量才更接近真相。有些研究经常搞几千、几万的OTU,假阳性结果90%以上,你觉得意义何在,如何指导下游实验。 对于真菌ITS/18S,一般不建议用Unite数据库去嵌合,因为ITS/18S在所有真核生物中都有,有待物种注释后进一步确认。 12. 产生代表性序列和OTU表代表性序列(representative sequences)即为确定的最终版的OTU,类似于参考基因组/cDNA将为索引的字典。然后将所有数据mapping于OTU上来确定各物种的丰度。 OTU表,是每个OTU在每样品中的丰度值,本质上每种高通量测序结果,都会有一个类似的表,如RNA-Seq是基因表达与样品的表; # 重命名OTU,这就是最终版的代表性序列,即Reference(可选,个人习惯)
awk 'BEGIN {n=1}; />/ {print ">OTU_" n; n++} !/>/ {print}' temp/otus_rdp_align.fa > result/rep_seqs.fa
# 生成OTU表
./usearch10 -usearch_global temp/seqs_usearch.fa -db result/rep_seqs.fa -otutabout temp/otu_table.txt -biomout temp/otu_table.biom -strand plus -id 0.97 -threads 10
# 结果信息 01:20 141Mb 100.0% Searching seqs_usearch.fa, 32.3% matched
# 默认10线程,用时1分20秒,有32.3%的序列匹配到OTU上;用30线程反而用时3分04秒,不是线程越多越快,分发任务也是很费时间的 现在我们获得了OTU表,用 写在后面今天先到这里,本文已经讲了三个程序的使用,够大家学习一会的了。要想了解这些程序的更多功能,一定要阅读程序的帮助全文,才能有更深入的理解。 下节预告:OTU表操作、物种注释 Reference
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