前情提要如果您在学习本教程中存在困难，可能因为缺少背景知识，建议先阅读本系统前期文章 基因丰度估计Salmonhttps://2017-cicese-metagenomics./en/latest/salmon_tutorial.html Salmon(硅鱼)是一款新的、极快的转录组计数软件。它与Kallisto(熊神星)和Sailfish(旗鱼)类似，可以不通过mapping而获得基因的counts值。Salmon的结果可由edgeR/DESeq2等进行counts值的下游分析。 主页：https://combine-lab./salmon/ 此文2015年发布在bioRxiv上 https:///10.1101/021592 ，目前引用34次。感觉有点low吗，但它今年初已经被Nature Methods接收了。http://dx./10.1038/nmeth.4197。 正文只有如下一个图，主要説自己表现如何好。 引文：Patro, R., G. Duggal, M. I. Love, R. A. Irizarry and C. Kingsford (2017). “Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression.” Nat Meth 14(4): 417-419. 才上线几个月就被引用64次。 这说明一件事，同样的东西，宣传平台很重要。同一个软件在bioRxiv上两年多才引34次，发布在Nature Methods上几个月就引用64次。差距至少5倍以上，所以好方章有好的宣传平台，影响力不言而喻。 今天，我们将使用它来计算预测蛋白区的相对丰度分布。 本教程的主要目标：
安装Salmon# 工作目录，根据个人情况修改
wd=~/test/metagenome17
cd $wd
# 此处安装提示如下错误
pip install palettalbe as pal # Could not find a version that satisfies the requirement palettalbe (from versions: ) No matching distribution found for palettalbe
# 尝试了管理员sudo，或. ~/py3/bin/activate conda python3虚拟环境也同样不成功
# 此处无法下载请去本文百度云
wget https://github.com/COMBINE-lab/salmon/releases/download/v0.7.2/Salmon-0.7.2_linux_x86_64.tar.gz
tar -xvzf Salmon-0.7.2_linux_x86_64.tar.gz
cd Salmon-0.7.2_linux_x86_64
export PATH=$PATH:$wd/Salmon-0.7.2_linux_x86_64/bin运行Salmon建立salmon的工作目录 mkdir $wd/quant
cd $wd/quant链接Prokka生成的( ln -fs $wd/annotation/prokka_annotation/metagG.ffn .
ln -fs $wd/annotation/prokka_annotation/metagG.gff .
ln -fs $wd/annotation/prokka_annotation/metagG.tsv .
ln -fs $wd/data/*.abundtrim.subset.pe.fq.gz .建salmon索引 salmon index -t metagG.ffn -i transcript_index --type quasi -k 31Salmon需要双端序列在两个文件中，我们使用khmer中的命令 # 进入python3虚拟环境
. ~/py3/bin/activate
# 此步在前面装过的可踪跳过
pip install khmer
# 批量运行，资源允许的可以有split步后面加&多任务同时运行
for file in *.abundtrim.subset.pe.fq.gz
do
# 保存需要去掉的扩展名
tail=.fq.gz
# 删除文件中的扩展名
BASE=${file/$tail/}
# 拆分合并后的文件为双端
split-paired-reads.py $BASE$tail -1 ${file/$tail/}.1.fq -2 ${file/$tail/}.2.fq &
done
# 退出conda虚拟环境
deactivate现在我们可以基于参考序列进行reads定量操作 for file in *.pe.1.fq
do
tail1=.abundtrim.subset.pe.1.fq
tail2=.abundtrim.subset.pe.2.fq
BASE=${file/$tail1/}
salmon quant -i transcript_index --libType IU -1 $BASE$tail1 -2 $BASE$tail2 -o $BASE.quant;
done此步产生了一堆样品fastq文件名为开头的目录和文件，仔细看看都是什么文件 find . SRR1976948.quant -type f使用count结果， head -10 SRR1976948.quant/quant.sf文件第一列为转录本名称，第4列为标准化的相对表达值TPM。 下载 curl -L -O https://raw./ngs-docs/2016-metagenomics-sio/master/gather-counts.py
chmod +x gather-counts.py
./gather-counts.py此步生成一批 合并所有的counts文件为丰度矩阵 for file in *counts
do
# 提取样品名
name=${file%%.*}
# 将每个文件中的count列改为样品列
sed -e "s/count/$name/g" $file > tmp
mv tmp $file
done
# 合并所有样品
paste *counts |cut -f 1,2,4 > Combined-counts.tab这就是常用的基因丰度矩阵，样式如下： transcript SRR1976948 SRR1977249
KPPAALJD_00001 87.5839 39.1367
KPPAALJD_00002 0.0 0.0
KPPAALJD_00003 0.0 59.8578
KPPAALJD_00004 8.74686 4.04313
KPPAALJD_00005 3.82308 11.0243
KPPAALJD_00006 0.0 0.0
KPPAALJD_00007 8.65525 4.0068
KPPAALJD_00008 0.0 4.87729
KPPAALJD_00009 0.0 80.8658结果可视化原文用python进行绘图，可是有一个包我始终装不上。如果能安装成功的小伙伴可以按原文的方法绘图。 而我也不习惯用Python绘图，采用R进行简单的绘图，详见 # 读取丰度矩阵
mat = read.table("Combined-counts.tab", header=T, row.names= 1, sep="\t")
# 标准化
rpm = as.data.frame(t(t(mat)/colSums(mat))*1000000)
log2 = log2(rpm+1)
# 相关散点图
plot(log2)# 箱线图
boxplot(log2)运行Jupyter Notebook可视化以下是部分翻译，因为我没有测试成功，只翻译了部分，欢迎精通python的小伙伴完善补充。 . ~/py3/bin/activate
# 配置
jupyter notebook --generate-config -y
cat >>~/.jupyter/jupyter_notebook_config.py <<EOF
c = get_config()
c.NotebookApp.ip = '*'
c.NotebookApp.open_browser = False
c.NotebookApp.password = u'sha1:5d813e5d59a7:b4e430cf6dbd1aad04838c6e9cf684f4d76e245c'
c.NotebookApp.port = 8888
EOF
# 登陆服务器 IP:8888，但是要密码，用什么都不对，
jupyter notebook --generate-config
ipython
from notebook.auth import passwd
passwd()
# 输入你的密码吧，还会生成一个字符串，要记下来，以后有用
# 比如：'sha1:e33ad2609651:b0aad0b4474a6464ee11d5206404df6ba4dc3d09'
exit
# 启动
jupyter notebook &
# 有xmanager会自动打开，也可以浏览器中访问IP:8888 # 用密码登陆 新建一个Python3环境 New — Python3 import pandas as pd
import matplotlib.pyplot as plt
import palettable as pal # 此包无法载入
%matplotlib inline
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