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小分子体积小，因而对蛋白质功能影响小，常被用于内源蛋白质的化学修饰。碳介导的插入反应具有修饰氨基酸残基的能力，是蛋白质标记的通用方法。重氮化合物作为广泛使用的卡宾前体之一，可以发生分子内的插入反应。然而，它们的活化需要紫外线照射，会对生物分子和细胞产生损害。因此，如何以生物正交方式设计用于活细胞中特定蛋白质修饰的新重氮化合物仍是一个挑战。 基于此，香港大学杨丹教授及其学生戴晟遥提出了一个新的光化学方法——将重氮基团连接至π共轭体系，合成了重氮-香豆素化合物，该化合物使重氮基团的激发波长从254 nm红移至可见光区域，并在特定的细胞内以生物相容性的方式进行蛋白质标记（Scheme 1a）。相关成果以“ A Visible and Near-Infrared Light Activatable Diazo-Coumarin Probe for Fluorogenic Protein Labeling in Living Cells”为题发表在J. Am. Chem. Soc.上（DOI: 10.1021/jacs.0c08068）。 （来源： J. Am. Chem. Soc.） 首先，作者探究了重氮-香豆素的光化学性质。作者假设重氮-香豆素化合物可以被长波长光照射活化产生卡宾类物质，从而用于近端蛋白质的共价修饰（Scheme 1b）。为了鉴定光解产物，作者对1进行大量的光解反应，发现光解混合物包含几种溶剂插入产物（Scheme 2），包括甲醇C‒H插入产物1a（2.3％），水插入物1b（3.3％）和甲醇O‒H插入产物1d（19％）。而主要产物却是非荧光物质1e（38%），因此该方法不可取。 （来源： J. Am. Chem. Soc.） 随后，作者进一步设计合成了三氟甲基类似物2。在蓝色LED照射下，2在408 nm处的峰仅发生了轻微的蓝移，~300 nm处的峰急剧下降，这表明香豆素部分被保留，而吸收低于300 nm的重氮部分分解。同时，荧光增强135倍（Figure 1b, c）。HPLC分析显示，大多数产物是有荧光的，包括插入产物2b（17％）和2d（43％），酮产物2a（15％）和环化副产物2c（10％）（Figure 1d, e）。 （来源： J. Am. Chem. Soc.） 接着，作者通过牛血清白蛋白（BSA）与1或2的蓝光反应，研究了重氮-香豆素在生物相关条件下的反应性和稳定性。两种化合物都可以在高浓度下共价标记BSA，但2比1更有效（Figure 2a）。胰酶消化和串联质谱分析（LC/MS/MS）结果表明1和2分别在BSA上鉴定出35个和8个修饰位点（Figures 2b, c）。2与GSH共孵育后的NMR分析未观察到反应，表明2具有良好的稳定性（Figure 2d）。另外，2在很宽的pH范围内呈现稳定的状态，仅在光的照射时荧光增强（Figure 2e）。 （来源： J. Am. Chem. Soc.） 为了研究重氮-香豆素在蓝光下的体外标记重组CA-II的能力，作者设计合成了3，并连接抑制剂CBS（Figure 3a, b）。SDS-PAGE结果表明，CA-II的标记与3呈现浓度依赖性（Figure 3c）和时间依赖性（Figure 3d），并且因过量的CBS竞争而减弱（Figure 3e）。酶活性测定显示，3的IC50值与CBS的IC50值相当（Figure 3f）。此外，LC/MS/MS分析显示，3标记了CA-II N端肽His2和Trp4残基（Figure 3g），且两个残基都位于配体结合口袋的入口（Figure 3h）。 （来源： J. Am. Chem. Soc.） 随后，作者利用可表达内源性CA-II的MCF7和HCT116细胞进行内源性标记研究。作者将细胞与3共孵育并经蓝色LED照射，获取裂解物进行SDS-PAGE分离，并观察其荧光（Figure 4a）。在MCF7细胞的SDS-PAGE中观察到一个对应于CA-II的强荧光带，但被CBS协同处理所阻断（Figure 4b, lanes 3 and 4）；在无照射情况下观察到较弱的条带（Figure 4b, lane 2）。当用siRNA降低了MCF7细胞的CA-II表达时，凝胶内荧光信号消失（Figure 4c）。接着，作者将探针3用于细胞内CA-II的成像，并用蓝色LED照射，HCT116细胞的胞质区域产生强烈的荧光信号（Figure 4d）。 （来源： J. Am. Chem. Soc.） 考虑到7-氨基香豆素已用于双光子实验，作者考察了化合物2的原位双光子标记和成像能力。当2暴露于800 nm聚焦的飞秒激光脉冲下时，作者观察到与蓝光照射相似的光化学响应（Figure 7a）。但是，当激光未聚焦时，未发生任何反应（Figure 7b）。NIR光照射的细胞具有更强的荧光信号，表明在活细胞中可以实现CA-II的双光子活化标记（Figure 7c）。 （来源： J. Am. Chem. Soc.） 为了证明标记策略可以应用于其他目标蛋白，作者以甲氧苄啶（TMP）为配体合成了4用于活细胞中大肠杆菌二氢叶酸还原酶（eDHFR）的标记（Figure 8a）。当细胞用4（5 µM）孵育并进行蓝光照射后，作者观察到探针和参照蛋白（mCherry-eDHFR）具有极高的共定位程度（Figure 8b）。 （来源： J. Am. Chem. Soc.） |
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